基于适配体分子操纵和亲和优化策略的生物传感检测技术研究
保障食品安全不仅对食品全产业链的发展尤为关键，同时对于人和动物的健康极为重要。目前，相比于外源性的食品安全问题，内源性食品安全问题由于待测物质种类繁多，缺乏有效的现场快速检测技术等问题，受到越来越多研究者的关注。其中，真菌毒素具有污染范围广、毒性强的特点，而过敏原存在天然致敏性等问题。适配体是一种具有高亲和力、强特异性、高稳定性、易合成和修饰等诸多优点的新型的生物识别元件，已被广泛应用于食品安全领域。因此，本文以食品内源性安全问题真菌毒素和过敏原蛋白作为研究对象，利用分子操纵技术和亲和优化策略，设计高亲和力、高特异性的新型适配体，开发简单快速、准确性高、灵敏度高、特异性强的适配体传感检测方法。具体研究内容如下： （1）选择黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）作为模式分子，采用其序列组成、长度和亲和力均不同的适配体A80和B50，基于纳米金（gold nanoparticles，AuNPs）的距离依赖光学特性，开发了简单快速、低成本、肉眼可视的适配体-AuNPs比色传感法，并评价适配体的实际应用性。通过反应条件优化，得到A80和B50在玉米油样品中检测AFB1的线性范围均为64~3200 nM，检测限（limit of detection，LOD）分别为33.82和43.40 nM，加标回收率分别为98.2~109.1%和102.5~105.0%。同时，研究表明A80的实际应用性较优于B50。 （2）针对适配体在实际检测中灵敏度不足问题，通过改善适配体亲和力以提高其实际应用性。引入计算机仿真方法，预测B50与AFB1的结合位点，基于二价亲和策略，利用分子操纵技术设计了二价适配体B72。通过分子对接模拟、微量热泳动法（microscale thermophoresis，MST）和等温滴定量热法（isothermal titration calorimetry，ITC）研究，得到高亲和力的二价识别AFB1适配体B72，亲和力提高了188倍。此外，基于AuNPs类过氧化物酶催化活性开发了比色传感法，得到B72检测AFB1的线性范围为5~5120 nM，LOD为1.88 nM，加标回收率为91.5~117.6%。 （3）针对满足多靶标检测需求，利用二价亲和策略和分子操纵技术，构建可同时识别双靶标的双功能适配体。选择玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）和赭曲霉毒素A（ochratoxin，OTA）作为靶标分子，基于结构分析设计了双功能适配体。通过分子对接和MST研究，确证了其同时识别ZEN和OTA的理论和实际可行性。此外，开发了灵敏、高通量的双功能适配体-MST传感方法，该方法同时检测玉米油样品中ZEN和OTA混合物的线性范围为4.88 nM~5μM，LOD为0.12 nM，加标回收率为93.3~104.2%。 （4）针对二价亲和策略和分子操纵技术设计结构嵌合适配体的适用性问题，选择OTA的G-四链体（1.12.2）和三螺旋（OBA3）适配体进行研究。通过MST亲和力和热力学表征、圆二色（circular dichroism，CD）光谱和稳态动力学研究，得到亲和力和DNA酶催化活性增强的混合G-四链体1.12.2二聚体（1.12.2-D0）。此外，基于G-四链体/血红素的类过氧化物酶催化活性开发了简单、灵敏、特异性强的比色传感方法，得到1.12.2-D0检测OTA的线性范围为3.13~600 nM，LOD为0.26 nM，玉米油样品中加标回收率为94~101.5%。 （5）为了进一步降低检测成本，基于序列截短和碱基突变的亲和策略，利用分子操纵技术设计A80的短序列适配体。通过MST、生物膜干涉技术（biolayer interferometry，BLI）和CD光谱表征，获得了亲和力相当、特异性强的22碱基的截短突变适配体A22-m2。此外，基于AuNPs的类过氧化物酶催化活性开发比色传感法，通过差值法优化反应条件以提高检测灵敏度，得到A22-m2检测AFB1的线性范围为3.13~800 nM，LOD为0.61 nM，玉米油样品中加标回收率为98.9~107.1%。 （6）为了验证截短亲和优化策略和分子操纵技术的普适性，选择β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）作为大分子研究对象。通过结构分析设计了β-LG的58个碱基适配体（B58）的截短适配体，利用MST、BLI和CD光谱技术表征，获得了高亲和力、高特异性的10个碱基长度的截短适配体B10。此外，基于AuNPs距离依赖的光学特性开发了比色传感法，通过AuNPs粒径优化，得到B10在16 nm的AuNPs下具有较好的检测性能。B10检测β-LG的线性范围为0.31~20 nM，LOD为0.02 nM，加标回收率为97.2~109.7%。 本文通过分子操纵技术与亲和优化策略成功设计了多种新型适配体，并基于新型适配体成功开发了多种简单、快速、灵敏、高选择性的传感方法，检测实际样品中的真菌毒素和过敏原蛋白。本文为适配体的亲和优化提供了一个通用方案，为开发高灵敏度、高选择性的适配体生物传感分析方法提供了参考，对其他领域适配体的研究具有重要意义。
生物传感检测;适配体;分子操纵;亲和优化策略
北京化工大学
博士
化学工程与技术
董益阳
2022
中文
TS207.3;TS201.6;O657.3
2022-11-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）