黄芩苷对耐药淋球菌的抗菌增敏作用及其机制的实验研究
研究背景：性传播疾病在全球一直呈现流行趋势。其中淋病奈瑟氏菌（简称淋球菌）感染引起的淋病仍无有效干预措施，一直是全球重大公共卫生问题。 目的：抗生素是治疗淋球菌有效手段，但大量耐药菌株产生是困扰临床治疗的重大问题，因此对于淋球菌耐药机制研究并寻找有效的药物分子靶点是干预淋球菌感染有效途径。本课题研究黄芩苷联合抗生素对耐药淋球菌的抗菌增敏作用，并且探讨淋球菌MlaA蛋白表达与其耐药的分子机制。 方法：体外实验：（1）检测黄芩苷联合抗生素的作用：棋盘稀释法测定黄芩苷和抗生素对不同耐药淋球菌的最小抑制浓度（MIC），判断黄芩苷联合抗生素对耐药淋球菌的作用，结合Time-Kill实验确定黄芩苷联合青霉素的抗菌增敏作用；（2）抗淋球菌MlaA多克隆抗体的制备：应用原核表达载体构建淋球菌MlaA重组蛋白，用诱导剂IPTG进行诱导表达，镍柱亲和层析进行纯化，WesternBlotting法检测目的蛋白分子量大小，纯化后的蛋白免疫小鼠制备MlaA多克隆抗体，ELISA法检测血清中抗体效价，WesternBlotting法检测抗体特异性结合活性及淋球菌MlaA蛋白表达情况；（3）淋球菌MlaA基因表达水平的分析：qRT-PCR及WesternBlotting检测淋球菌MlaA基因的表达水平；（4）细菌外膜囊泡（OMV）的提取及鉴定：透射电镜检测OMV形态结构，纳米粒径分析淋球菌OMV直径大小，细胞纳米流式检测淋球菌OMV分泌数量。 体内实验：采用WHOL株菌悬液注入小鼠阴道建立淋球菌感染模型，同时给予黄芩苷和青霉素单药或联合用药处理，用药结束后处理动物。饲养期间，在不同时间内取小鼠阴道拭子进行检测，瑞氏染色检测小鼠动情周期，革兰染色、TM平板培养及淋球菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）检测小鼠阴道内淋球菌生长情况；取小鼠生殖道观察小鼠生殖道形态及炎症情况。 结果：(1)黄芩苷对WHOL株MIC值为4mg/mL，青霉素对WHOL株MIC值为4μg/mL；黄芩苷与不同抗生素联合，通过计算分级抑菌浓度（FIC）指数，黄芩苷在一定浓度范围内与抗生素具有较好的协同或相加作用，其中，与青霉素联合作用于WHOL株协同作用效果明显，可提高WHOL株对青霉素的敏感性（1mg/mL浓度的黄芩苷可以使青霉素从耐药浓度4μg/mL降低到敏感浓度0.125μg/mL）。（2）成功构建淋球菌感染小鼠模型；黄芩苷联合青霉素可抑制WHOL株在小鼠生殖道内增殖及抑制局部炎症反应。（3）成功制备淋球菌MlaA多克隆抗体，抗体灵敏度高，特异性较好。（4）成功提取淋球菌OMV；黄芩苷联合青霉素作用于WHOL株时，淋球菌MlaA表达升高，OMV分泌减少。 结论：（1）体外研究发现黄芩苷联合不同抗生素具有较好协同或相加作用。 （2）体内外研究均发现黄芩苷联合青霉素可有效抑制耐药淋球菌WHOL株的生长。 （3）黄芩苷联合青霉素能够通过增加淋球菌MlaA蛋白表达，抑制OMV分泌，改善淋球菌对青霉素的耐药性。
性传播疾病;耐药淋球菌;黄芩苷;抗生素;抗菌增敏
三峡大学
硕士
基础医学
刘朝奇;赵云
2022
中文
R285.5;R515
2022-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）