抑制LSD1增强ER+乳腺癌内分泌治疗应答的机制研究
研究背景：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，占女性癌症死亡率的首位。乳腺癌具有高度异质性，分子分型分为LuminalA（ER（雌激素受体）+/PR（孕激素受体）+/HER2（人表皮生长因子2）-）型、LuminalB（ER+/PR-/HER2-）型、HER2+（ER±/PR±/HER2+）型和Basal-like（ER-/PR-/HER2-）型。其中ER+（LuminalA和B）乳腺癌为最常见的乳腺癌亚型，占比约80％。内分泌治疗为此类病人的主要治疗方法，能有效降低复发率和死亡率，但因治疗耐药性，治疗效果仍有差距。研究表明表观遗传调控紊乱可能导致ER+乳腺癌内分泌治疗耐药，因此，探究表观遗传在ER+乳腺癌内分泌治疗中发挥作用的分子机制尤为重要。组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶LSD1（Lysine-specificdemethylase1）是一种表观调控蛋白，它能催化H3K4和H3K9的单甲基或双甲基去除，从而抑制或激活基因的转录。LSD1参与多种癌症的发生发展，目前对于LSD1在ER+乳腺癌内分泌治疗中的作用及机制尚不十分清楚，因而，LSD1调控ER+乳腺癌内分泌治疗的机制仍需进一步探索。 目的：本课题旨在探究LSD1在ER+乳腺癌内分泌治疗中发挥的作用及其机制，为解决临床ER+乳腺癌病人内分泌治疗耐药提供新思路和方法。 方法：(1)检索GEO数据库分析LSD1在ER+乳腺癌患者内分泌治疗前后肿瘤中的表达情况。(2)细胞增殖实验检测LSD1抑制剂及ER抑制剂（4-羟他莫昔芬/4OHT）在不同ER+乳腺癌细胞中的72hIC50值，利用CompuSyn软件评估两药对细胞的协同抑制指数CI值；检测LSD1抑制剂联合ER抑制剂（氟维司群/fulvestrant）对MCF7细胞增殖的影响。(3)慢病毒包装系统构建LSD1稳定敲低（shLSD1）和过表达（LSD1-OE）ER+乳腺癌细胞系，并验证敲低和过表达效率，检测细胞对4OHT的敏感性。(4)Timer2.0网站分析KDM1A（LSD1别称）与ESR1（ESR1是编码ERα的基因名称）在LuminalA型乳腺癌中表达相关性；RT-qPCR和Westernblot检测使用不同LSD1抑制剂及稳定敲低LSD1后，ESR1（ERα）的mRNA和蛋白表达水平；利用CHX和MG-132抑制蛋白质合成和降解途径，Westernblot检测LSD1抑制剂对ERα蛋白稳定性的影响；利用ER抑制剂处理细胞后检测LSD1的mRNA和蛋白表达变化。(5)GSVA及GSEA分析雌激素信号通路与LSD1表达量相关性；使用LSD1抑制剂处理后分析雌激素信号通路相关基因GREB1和TFF1的mRNA表达水平；双荧光素酶报告基因检测LSD1抑制后或挽救回补ESR1或LSD1后ERα转录活性。(6)韦恩图（Venn）分析抑制LSD1和ERα后共同调控下游基因；KEGG信号通路分析受LSD1和ERα共同调控基因的信号通路；TCGA数据库分析KDM1A和ESR1基因表达量与p53信号通路相关性；流式细胞术检测LSD1抑制剂（苯环丙胺/TCP）协同ER抑制剂（4OHT）对MCF7细胞周期的影响；RT-qPCR检测p53信号通路关键基因ATR和CHEK1的mRNA表达水平。(7)小鼠荷瘤模型评估LSD1抑制剂与内分泌治疗（他莫昔芬）在ER+乳腺癌中的协同作用，并取各脏器行Hamp;E染色观察组织形态。 结果：(1)通过搜索GEO数据（GSE33658），发现LSD1在内分泌治疗应答乳腺癌病人肿瘤中表达明显下调，而在无应答病人无明显改变。(2)通过细胞增殖实验，发现LSD1抑制剂与ER抑制剂在ER+乳腺癌细胞中具有协同抑制效果，且敲低LSD1增强细胞对4OHT的敏感性，过表达LSD1降低细胞对4OHT的敏感性。(3)通过GSVA分析、GSEA分析、双荧光素酶报告基因系统，RT-qPCR技术发现雌激素信号通路与LSD1高表达成正相关，抑制LSD1降低ERα转录活性。(4)通过RT-qPCR技术、Westernblot技术、生物信息分析，发现LSD1与ESR1的表达成正相关，抑制LSD1在转录水平下调ESR1的表达，而不在蛋白降解途径影响ERα的表达。(5)通过生物信息分析和RT-qPCR实验验证，发现抑制LSD1或ERα通过激活p53信号通路，协同下调ATRmRNA水平，阻滞细胞周期在G1期，从而抑制ER+乳腺癌细胞增殖。(6)对ER+乳腺癌细胞荷瘤小鼠模型进行单药或药物联合治疗，结果表明LSD1抑制剂能协同他莫昔芬治疗ER+乳腺癌荷瘤小鼠，且无明显毒性作用，Hamp;E染色观察各组间脏器组织形态学无明显差异。 结论：LSD1对ER+乳腺癌病人内分泌治疗应答具有重要意义。体内外实验证明，抑制LSD1能协同增加ER+乳腺癌对ER抑制剂的敏感性，抑制LSD1可下调ESR1的表达，且抑制雌激素受体的转录活性，同时抑制LSD1和ERα可通过激活p53信号通路协同抑制ER+乳腺癌细胞增殖。靶向抑制LSD1有望成为增加ER+乳腺癌患者内分泌治疗敏感性，并减少耐药的新策略。
ER+乳腺癌;内分泌治疗;赖氨酸特异性去甲基化酶1;雌激素受体;免疫应答
三峡大学
硕士
基础医学
秦烨;曹春雨
2022
中文
R737.9
2022-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）