转录因子GATA3对哮喘易感基因ADAM33转录调控的研究
目的： 构建人ADAM33解整合素-金属蛋白酶33(a disintegrin and metalloproteinase33，ADAM33)基因启动子并鉴定其核心启动子区域；探讨转录因子GATA结合蛋白3(GATA binding protein3，GATA3)过表达及敲低对ADAM33基因启动子活性的影响；探索转录因子GATA3与ADAM33启动子区域在体内是否可以结合；探讨过表达及敲低GATA3对ADAM33mRNA表达的影响。 方法： 以BEAS-2B细胞DNA为模板经PCR扩增得到ADAM33基因启动子区1953bp片段。通过双酶切、连接、转化等步骤将该片段克隆至pGL3-Basic载体构建ADAM33启动子重组质粒，并将其转染至人HEK293T、BEAS-2B细胞中，利用双荧光素酶报告基因技术检测在HEK293T、BEAS-2B细胞中所构建的质粒启动子活性。以构建的重组质粒为模板，克隆得到一系列ADAM33基因5’侧翼区逐段缺失的不同长度的截短重组质粒，利用双荧光素酶报告基因技术鉴定ADAM33核心启动子区域，并鉴定一系列截短质粒的启动子活性。利用JASPAR database(http://jaspar.genereg.net/)在线软件预测ADAM33启动子区域潜在的GATA3结合位点，将HEK293T、BEAS-2B细胞分别分为pcDNA-GATA3组和pcDNA3.1对照组、si-GATA3组和si-control对照组，进行瞬时转染，用双荧光素酶报告基因技术检测转录因子GATA3过表达及敲低对ADAM33基因启动子活性的影响。利用染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecitation，ChIP)实验鉴定转录因子GATA3与ADAM33启动子区域在体内是否可以结合。将pcDNA-GATA3质粒、pcDNA3.1质粒、si-GATA3及si-control分别转染至BEAS-2B细胞，用实时荧光定量PCR检测BEAS-2B细胞中ADAM33mRNA相对表达水平。 结果： 1.通过双酶切、连接、转化和测序鉴定，成功构建含ADAM33启动子片段的重组质粒；在HEK293T、BEAS-2B细胞中，含ADAM33启动子区的重组质粒的启动子活性较pGL3-Basic对照组明显增高。 2.在HEK293T、BEAS-2B细胞中，分析ADAM33基因5’端截短质粒的启动子活性时发现，当启动子质粒从-290bp缺失到-24bp位置，构建的质粒启动子活性出现大幅度下降，说明ADAM33核心启动子序列位于﹣290bp~+73bp之间。 3.生物信息学预测ADAM33启动子区域包含多个转录因子GATA3的结合位点，核心启动子区域包含2个GATA3结合位点。 4.在HEK293T、BEAS-2B细胞中，与pcDNA3.1组相比，pcDNA-GATA3组ADAM33启动子区荧光素酶活性明显增高(Plt;0.05或Plt;0.01)；与si-control组相比，si-GATA3组ADAM33启动子荧光素酶活性明显降低（Plt;0.05)，表明GATA3可正向调控ADAM33启动子活性。 5.ChIP实验证明GATA3与ADAM33启动子区域在体内能结合。 6.实时荧光定量PCR检测，结果显示：与pcDNA3.1组相比，BEAS-2B细胞中pcDNA-GATA3组ADAM33mRNA相对表达量显著增加(Plt;0.05)，与si-control组相比，si-GATA3组ADAM33mRNA相对表达量降低(Plt;0.05)；表明GATA3可正向调控ADAM33mRNA表达。 结论： 人ADAM33核心启动子序列位于﹣290bp~+73bp之间，转录因子GATA3能够正向调控ADAM33启动子活性及mRNA表达。
哮喘;GATA结合蛋白3;ADAM33基因;基因调控
江苏大学
硕士
儿科学
束进
2022
中文
R562.25
2022-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）