苜蓿HD-Zip转录因子基因Mfhb-1对拟南芥和苜蓿的遗传转化及抗旱性研究
Mfhb-1基因是在苜蓿体细胞胚胎发生初期通过扣除杂交得到的，生物信息学分析表明，该基因属于同源异域型-亮氨酸拉链蛋白（Homeodomain-leuzine zipper protein，HD-Zip）Ⅰ类转录因子基因。目前，对转录因子的研究逐渐全面而深入，越来越多的HD-ZipⅠ类转录因子被发现参与植物的抗旱应答、胚胎发育和光形态建成等过程。为了全面研究Mfhb-1基因生物学功能，本课题以野生型哥伦比亚拟南芥为起始材料，通过根癌农杆菌介导的遗传转化体系，将Mfhb-1基因转入到拟南芥中，经分子生物学鉴定后得到转Mfhb-1基因拟南芥植株。再以转Mfhb-1基因拟南芥及野生型拟南芥为研究对象，利用停止浇水的方法模拟干旱胁迫，观测转Mfhb-1基因拟南芥和野生型拟南芥的表观形态，检测Mfhb-1基因拟南芥中的表达水平，检测转Mfhb-1基因拟南芥和野生型拟南芥中抗旱性相关的生理生化指标，对两组拟南芥的抗旱性做出评价，主要研究结果如下： （1）完成Mfhb-1基因对拟南芥的遗传转化，获得拟南芥Mfhb-1基因转化植株。 （2）对Mfhb-1基因转化拟南芥植株进行分子生物学筛选获得了T3代纯合拟南芥株系。 （3）提取T3代纯合拟南芥的总DNA进行PCR反应后进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示出1300bp的目的条带，初步证明Mfhb-1基因已成功整合到拟南芥的基因组中。 （4）对T3代纯合转Mfhb-1基因拟南芥RNA进行琼脂糖凝胶电泳和质量检测，反转录得到cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示出250bp的目的条带，进一步证明了Mfhb-1基因已成功转入拟南芥中，并在拟南芥中成功表达。 （5）利用停止浇水的方法对T3代纯合转Mfhb-1基因拟南芥和野生型拟南芥进行干旱胁迫，分别在干旱的不同时间段对T3代纯合Mfhb-1转基因拟南芥进行实时荧光定量表达检测，结果显示Mfhb-1基因的表达水平随干旱时间的延长而显著增高。 （6）分别在干旱的不同时间段观测两组拟南芥的表观形态、测定两组拟南芥抗旱相关的生理生化指标，结果显示转基因组拟南芥生长状态和各项抗旱性指标均优于野生组。 （7）通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法得到了转Mfhb-1基因紫花苜蓿植株。本试验中紫花苜蓿遗传转化体系最佳侵染液OD值为0.55，最佳侵染时间为10min，最佳潮霉素的筛选浓度为35mg/L。 （8）对转Mfhb-1基因紫花苜蓿植株外施潮霉素进行筛选，得到12株具有潮霉素抗性的紫花苜蓿植株。对12株紫花苜蓿进行PCR检测和RT-PCR检测，电泳结果显示转Mfhb-1基因紫花苜蓿植株的总DNA与阳性质粒DNA成功扩增出了1300bp的目的条带，转Mfhb-1基因紫花苜蓿的RNA和阳性质粒DNA均能扩增出250bp的目的条带。证明Mfhb-1基因已经成功整合到紫花苜蓿的基因组中，并且已在紫花苜蓿中成功表达。 结果表明，在正常生长条件下，转Mfhb-1基因拟南芥和野生型拟南芥的表观形态并无明显区别，两组间的生理生化相关抗性指标也无显著性差异。但干旱诱导了Mfhb-1基因在拟南芥中的表达，产生的Mfhb-1转录因子参与调控了拟南芥对干旱的应答反应，从而增加了拟南芥中渗透调节物质的合成及积累，提高了拟南芥的保水能力，进而保证了叶绿素的合成、延缓了叶绿素的降解。同时Mfhb-1基因的表达提高了拟南芥中抗氧化物酶的酶活，增强了拟南芥对活性氧的清除能力，减轻了活性氧对质膜等的伤害。这些生理生化层面的差异使转基因组拟南芥的生长状况要优于对照组。总之，转Mfhb-1基因拟南芥表现出对干旱胁迫的更加适应，推测Mfhb-1基因的表达提高了拟南芥的抗旱能力。这为全面而深入的研究Mfhb-1基因的生物学功能及其功能发挥的作用调节机制提拱了理论依据和线索。此外，经农杆菌介导法已成功将Mfhb-1基因整合到紫花苜蓿中，为紫花苜蓿的品质改良提供了试验材料。
紫花苜蓿;Mfhb-1基因;遗传转化;抗旱性
河南科技学院
硕士
作物遗传育种
周岩
2022
中文
S541.034
2022-10-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）