人工纤维小体骨架蛋白的分子设计与自组装初探
工业革命的快速发展造成化石燃料的过度使用，使得温室效应，能源危机和环境污染等问题越来越严重。木质纤维素由于其较快的再生速度、相对较高的能量、原料充足、来源广泛，所以作为地球上最丰富的可再生资源之一。利用木质纤维素炼制生物能源和化学品来解决由于化石燃料过度使用所造成的问题具有广阔的应用前景。但是因为木质纤维素具有致密的晶体结构，成分比较复杂，纤维素酶的成本也比较高，所以其开发利用受到了很大的限制。 在自然界中，由厌氧菌分泌的一种高分子量的多酶复合体-纤维小体（cellulosome）能够有效降解木质纤维素。纤维小体通过骨架蛋白（scaffoldin）的粘附域（cohesin）与酶亚基的锚定域（dockerin）相互作用形成，骨架蛋白上的纤维素结合域（CBM）能特异性结合纤维素。但是天然骨架蛋白编码基因长度均很长且含有多个重复序列具有遗传不稳定性，异源表达系统无法大量合成天然全长的纤维小体骨架蛋白，因此本研究通过SpyTag/SpyCatcher、SnoopTag/SnoopCatcher介导的肽/蛋白共价偶联技术对纤维小体的骨架蛋白进行模块化分子设计，并对其进行自组装。 首先，建立SpyTag/SpyCatcher、SnoopTag/SnoopCatcher介导的肽/蛋白共价偶联技术体系。通过序列优化和PCR扩增合成了SpyCatcher、SnoopCatcher编码基因和融合的SpyTag、SnoopTag编码基因，将其克隆到pGEX-6P-1和pET-28a中，并通过原核表达纯化系统对克隆出的重组质粒进行表达纯化。SpyTag与SpyCatcher共价偶联实验发现SpyTag和SpyCatcher能自发形成稳定的共价异肽键。同时SnoopTag和SnoopCatcher也能自发形成稳定的共价异肽键。而且SpyTag和SnoopCatcher，SnoopTag和SpyCacther之间没有交叉反应。因此，初步建立了肽/蛋白共价偶联技术的体系。 其次，模块化骨架蛋白的分子设计及重组表达。以解纤维梭菌Ruminiclostridum cellulolyticum骨架蛋白为设计模板，分别设计骨架蛋白的功能区和组装区。功能区的设计：包括构建出融合了SpyTag且分别含有1-3个不同数量cohesin的重组质粒将其转化并表达纯化。组装区的设计：包括构建异源（Spy/Snoop）的pET28a-SpyTag-Cohesin1-SnoopTag和pET28a-SnoopCatcher-SpyCatcher的重组质粒将其转化并表达纯化。骨架蛋白的模块化分子设计为下一步的纤维小体骨架蛋白自组装奠定基础。 最后，纤维小体骨架蛋白进行自组装。自组装策略分别为非固定化自组装和固定化自组装。非固定化组装：分别将纯化的SpyTag介导的带有不同数量cohesin的蛋白和SpyCatcher介导的蛋白在不同摩尔比例下进行组装，通过SDS-PAGE发现骨架蛋白的最优组装条件。固定化组装：将纯化的SpyCatcher介导的蛋白模块通过其纯化标签固定在树脂柱材料上，然后依次交替直接加入未纯化的不含纯化标签的Tag和Catcher融合模块并洗去未反应蛋白，获得不同长度和聚合度的骨架蛋白，实现骨架蛋白的可控自组装，结果显示通过连续添加未纯化的不含纯化标签SpyTag-Cohesin1-SnoopTag和SnoopCatcher-SpyCatcher可实现链的延伸，组装成一个五聚体蛋白。因此，初步建立了基于肽/蛋白共价偶联技术的骨架蛋白设计与组装的方法。 总之，本研究利用肽/蛋白共价偶联技术对纤维小体的骨架蛋白进行分子设计，并初步组装成含有不同数量粘附域的骨架蛋白，不仅丰富和扩展了肽/蛋白质共价偶联技术的应用范围，而且为有工业应用潜力的高活性的人工纤维小体及其细胞工厂的构建提供新的设计思路并奠定技术基础。
纤维小体;骨架蛋白;模块化分子设计;自组装
山西大学
硕士
微生物学
许成钢
2022
中文
TQ936
2022-09-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）