miRNA-nov-1/Dhrs3介导mTOR信号通路调控锰诱导N27细胞凋亡的机制研究
目的：以大鼠多巴胺能神经元细胞系（简称“N27”细胞）构建慢病毒细胞稳转株，探讨miRNA-nov-1/Dhrs3在锰致N27细胞凋亡中的调控机制，以及mTOR信号通路关键分子变化的特点，进一步阐明锰致神经毒性的分子机制。 方法：1.N27细胞分为以下2组：MnCl20μmol/L(空白对照组，Control组)、300μmol/L（模型组，Model组）24h。CCK8检测细胞活力，Westernblot检测Dhrs3、凋亡相关蛋白（Caspase-3、Cleaved-caspase-3）和mTOR信号通路相关蛋白（mTOR、p-mTOR、p-S6K1、S6K1、p-4E-BP1、4E-BP1、p-Akt、Akt）的表达；RT-qPCR检测miRNA-nov-1、Dhrs3mRNA的表达；核酸序列比对软件预测miRNA-nov-1与Dhrs3的结合位点。 2.将N27细胞分为以下7组：空白对照组（Control组）、模型组（Model组）、锰+慢病毒空载组（NC组）、锰+miRNA-nov-1过表达组（miRNA-nov-1up组）、锰+miRNA-nov-1低表达组（miRNA-nov-1sponge组）、锰+沉默Dhrs3组（sh-Dhrs3组）、锰+miRNA-nov-1低表达+Dhrs3沉默组（miRNA-nov-1sponge+sh-Dhrs3组）。各组染锰剂量均为最佳染锰浓度（300μmol/L），染毒时间24h。用倒置显微镜观察各组的细胞形态；流式细胞仪检测细胞凋亡（AnnexinV/PI双染色法）；Hoechst33324荧光染色法检测细胞凋亡率；Westernblot检测Dhrs3、Caspase-3和mTOR信号通路相关蛋白（mTOR、p-mTOR、p-S6K1、S6K1、p-4E-BP1、4E-BP1、p-Akt、Akt）的表达；RT-qPCR检测miRNA-nov-1、mTOR、S6K1、4E-BP1、AktmRNA的表达。 结果：1.CCK8实验发现，锰对N27细胞活性的影响呈剂量效应关系，细胞的活性随剂量的增加而下降。Westernblot结果显示，与Control组相比，Model组Dhrs3表达下降（Plt;0.05），凋亡相关蛋白（Caspase-3、Cleaved-caspase-3）和mTOR信号通路磷酸化蛋白（p-mTOR、p-S6K1、p-4E-BP1、p-Akt）的表达增加（Plt;0.05），总蛋白（mTOR、S6K1、4E-BP1、Akt）的表达不变（Pgt;0.05）。RT-qPCR结果显示，与Control组相比，Model组的miRNA-nov-1表达上调，Dhrs3表达下调，差异具有统计学意义（Plt;0.05）。核酸序列比对软件预测miRNA-nov-1与Dhrs3存在结合位点。 2.Westernblot结果显示，与Model组和NC组相比，miRNA-nov-1up组和sh-Dhrs3组的Caspase-3、p-mTOR、p-Akt、p-S6K1、p-4E-BP1表达增加（Plt;0.05）；miRNA-nov-1sponge组的Caspase-3以及p-mTOR、p-Akt、p-S6K1、p-4E-BP1表达降低（Plt;0.05）；miRNA-nov-1sponge+sh-Dhrs3组的Caspase-3以及p-mTOR、p-Akt、p-S6K1、p-4E-BP1表达量无明显差异（Pgt;0.05）。与Model组和NC组相比，miRNA-nov-1up组和sh-Dhrs3组的Dhrs3表达下降(Plt;0.05)；miRNA-nov-1sponge+sh-Dhrs3组的Dhrs3表达量无明显差异（Pgt;0.05）。RT-qPCR结果显示，与Control组相比，其它6组miRNA-nov-1的表达量均增加（Plt;0.05），与Model组和NC组比较，miRNA-nov-1up组和sh-Dhrs3组miRNA-nov-1的表达量增加（Plt;0.05），miRNA-nov-1sponge+sh-Dhrs3组miRNA-nov-1表达无显著差异（Pgt;0.05）。与Control组相比，Model、NC、miRNA-nov-1sponge、sh-Dhrs3、miRNA-nov-1sponge+sh-Dhrs3组的mTOR、Akt、S6K1mRNA表达无显著差异（Pgt;0.05）。AnnexinV/PI双染流式细胞术检测结果显示，与Control组比较，其它6组的凋亡率明显升高(Plt;0.05)，与Model组和NC组相比，miRNA-nov-1up组和sh-Dhrs3组N27细胞的凋亡率明显升高（Plt;0.05）；miRNA-nov-1sponge组细胞的凋亡率明显下降（Plt;0.05）；miRNA-nov-1sponge+sh-Dhrs3组的凋亡率无显著差异（Pgt;0.05）。Hoechst33324荧光染色法检测结果显示，与Control组比较，其它6组细胞核呈致密浓染的凋亡细胞明显增多，与Model组和NC组相比，miRNA-nov-1up组和sh-Dhrs3组N27细胞的凋亡率明显升高；miRNA-nov-1sponge组细胞的凋亡率明显下降；miRNA-nov-1sponge+sh-Dhrs3组的凋亡率无显著性变化。 结论：1.锰致N27细胞凋亡中miRNA-nov-1表达上调，Dhrs3表达下调； 2.miRNA-nov-1可能通过负向调节Dhrs3激活mTOR信号通路促进锰诱导的N27细胞凋亡。
锰;miRNA-nov-1;Dhrs3;细胞凋亡;mTOR信号通路;神经毒性
遵义医科大学
硕士
卫生毒理学
李岩
2022
中文
R995
2022-09-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）