邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯分区调控NAD+致胎盘滋养细胞DNA损伤
目的：邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（Di(2-ethyl-hexyl)phthalate，DEHP）是一种环境内分泌干扰物，在PVC材料中被广泛用作增塑剂，易释放到环境并进入人体。DEHP通过干扰DNA断裂修复途径引起DNA损伤，抑制胎盘发育。然而，DEHP抑制DNA损伤修复的具体机制尚不清楚。多聚ADP核糖聚合酶1（Poly(ADP-ribose)polymerase1，PARP1）是DNA损伤后激活修复途径的关键分子，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamideadeninedinucleotide，NAD+）是PARP1活性的必需底物。本研究从NAD+的角度出发，探讨DEHP阻碍DNA损伤修复，抑制胎盘滋养细胞增殖的机制。 方法：第一部分：DEHP对胎盘细胞的DNA损伤。使用ICR小鼠，于孕期0-15天（GD0-15）灌胃暴露DEHP（0，5，50，200mg/kg/d），构建孕鼠胎盘细胞DNA损伤模型；WesternBlotting检测磷酸化γH2AX，PCNA蛋白表达，确认模型；使用MEHP（0，20，200，500μM）处理HTR-8细胞，通过彗星实验体外验证DEHP对DNA的损伤；HE染色评价胎盘最大纵截面和迷路滋养层面积改变，确定DEHP抑制胎盘发育。第二部分：孕期暴露DEHP对NAD+的影响。WST-8法检测孕鼠血清和胎盘中NAD+的含量；通过WesternBlotting检测NAD+合成和水解蛋白NAMPT，CD38和CD157的表达。第三部分：DEHP抑制胎盘滋养细胞增殖的机制。WesternBlotting检测PARP1，Parp-Par表达，判断DEHP对PARP1活性的影响；分离胎盘细胞核、胞浆和线粒体，检测各部分NAD+的浓度，评估DEHP对NAD+的分区调控；检测核NMNAT1，胞质NMNAT2和线粒体NMNAT3等NAD+合成蛋白表达，探索DEHP分区调控NAD+的原因；透射电镜观察线粒体数目和结构，RT-qRCR评价线粒体DNA拷贝数，免疫荧光计数线粒体；Seahorse检测HTR-8细胞ATP生成率；检测ACPM和OXPHOS蛋白表达表达，探究胎盘细胞呼吸链损伤。第四部分：NAD+前体补充对胎盘细胞DNA及线粒体损伤的挽救作用。构建孕期NAM干预的孕鼠模型，实验分为四组：对照组，NAM组（500mg/kg/d），DEHP组（50mg/kg/d），NAM+DEHP组。通过上述实验组合确定NAM的挽救功能。 结果：1）磷酸化γH2AX蛋白表达与DEHP浓度之间存在剂量依赖性增加；暴露DEHP使HTR-8细胞彗星尾距增加；PCNA表达降低，胎盘最大纵截面和胎盘滋养层面积降低。2）孕鼠血清，胎盘和HTR-8细胞NAD+含量降低；NAD+水解酶CD38，CD157表达升高，NAD+限速合成酶NAMPT无明显变化。3）PARP1蛋白表达无改变，但Par化活性降低；NMNAT1/2表达降低，NMNAT3表达升高；透射电镜、线粒体DNA拷贝数检测、体外荧光实验发现DEHP减少胎盘滋养细胞中线粒体的数量并破坏线粒体结构；线粒体呼吸链复合物I表达升高，II-V表达降低，Seahorse实验发现MEHP使HTR-8细胞ATP产量降低。4）NAD+前体NAM补充在一定程度上挽救DEHP引起的胎盘细胞DNA损伤和线粒体结构损伤。 结论：DEHP抑制胎盘滋养细胞胞质与核中NAD+的合成，促进线粒体NAD+的合成与转入；同时DEHP破坏线粒体结构，减少线粒体数量，损伤呼吸链，导致ATP产量下降。NAD+和ATP的减少抑制PARP1的活性，引起DNA断裂累积干扰胎盘滋养层发育。NAD+前体NAM的适量补充，减轻DEHP对DNA和线粒体的损伤。
邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸;胎盘;DNA损伤
安徽医科大学
硕士
卫生毒理学
赵玲俐
2022
中文
R114
2022-09-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）