鼠疫耶尔森氏菌201菌株在巨噬细胞内适应性进化的初步研究
目的鼠疫耶尔森氏菌（简称鼠疫菌）对哺乳动物具有强毒性，能在巨噬细胞内少量存活并最终裂解和逃逸巨噬细胞，进而经淋巴结引流扩散，引发败血症等次级感染。进入巨噬细胞后的鼠疫菌能在胞内形成保护性生态位，即含耶尔森菌液泡（YersiniaContainingVesicles，YCV），来抵抗胞内酸、过氧化物和水解酶类等杀伤。本课题为了研究巨噬细胞内生存过程对鼠疫菌的作用机制，将鼠疫菌在巨噬细胞内多次传代，模拟鼠疫菌在巨噬细胞内发生适应性进化的条件，研究多次胞内生存传代后鼠疫菌的变化情况。 方法将201菌株在小鼠巨噬细胞RAW264.7中连续传代，对原代菌株和传代菌株进行胞内生存实验比较两者在巨噬细胞内的生存率。将原代菌株和传代菌株的单菌落进行全基因组三代测序组装完成图，分析二者基因组的变化情况，结合表达谱数据，在发生突变的基因中选取hmsR基因，以自杀质粒同源重组的方式构建敲除株。对原代菌株、传代菌株和敲除菌株进行生长曲线实验、酸生存和过氧化氢生存实验、菌落褶皱实验和结晶紫染色实验、RTCA实验以及动物实验等，比较三株菌之间的表型差异。根据表型实验结果选取特定的培养条件进行三株菌的转录组测序，从基因表达层面解释适应性进化的机制。 结果将201菌株在RAW264.7中连续传50代后传代菌株胞内生存率由5%增高至18%，分离单菌落命名为201-MI（201-macrophageinduced）。通过对201-MI与201的基因组序列进行比对，未发现基因片段的缺失。发现一些单核苷酸突变（SNP），包括15个基因间区SNP、22个同义SNP（synonymousSNP）和22个非同义SNP（nonsynonymousSNP）。201-MI存在一些小的插入（InDel）和无义突变（nonsenseSNP），导致相应的基因翻译提前终止，无法产生与201菌株一样的完整蛋白质。其中hmsR基因编码一种糖基转移酶，是鼠疫菌形成生物膜的关键基因之一。在201菌株的基础上成功构建hmsR基因的无痕突变体ΔhmsR。 201、201-MI和ΔhmsR表型实验结果：（1）生长曲线实验表明，在LB内201-MI生长较201迟缓，在限制性培养基TMH内201-MI生长速率较201快。ΔhmsR和201在两种培养基内的生长情况均无明显差异（2）酸生存和过氧化氢生存实验结果表明，201-MI酸处理和过氧化氢处理后的生存率较201高，ΔhmsR和201在过氧化氢处理后生存率无明显差异。（4）菌落褶皱实验和结晶紫染色实验结果表明，201菌落中心区出现了明显的生物膜褶皱，201-MI和ΔhmsR菌落中心区为平整的磨砂状态，201结合结晶紫的能力显著强于201-MI和ΔhmsR。这说明201的生物膜形成能力强于201-MI和ΔhmsR。（5）RTCA实验表明，201-MI与201相比感染细胞后细胞指数降到0所需时间更长，ΔhmsR与201相比感染细胞后细胞指数降到0所需时间无明显差异。这说明在细胞水平上，201-MI对细胞的毒力较201弱，ΔhmsR对细胞的毒力与201无明显差异。（6）动物实验结果表明，感染201-MI的小鼠比感染201的小鼠存活更长时间，感染ΔhmsR的小鼠与感染201的小鼠存活时间无明显差异。这说明在动物水平上，201-MI对小鼠的毒力较201弱，ΔhmsR对小鼠的毒力与201无明显差异。（7）转录组结果表明，在酸刺激和过氧化氢刺激时，201-MI内与毒力密切相关的III型分泌系统多个基因发生大幅度下调。 结论201-MI在巨噬细胞内生存能力增强，能够适应更广泛的生存环境，酸刺激和过氧化氢刺激后，多数III型分泌系统的基因下调，对细胞和小鼠的毒力更弱。体外模拟巨噬细胞内鼠疫菌连续传代过程中，鼠疫菌生物膜形成基因hmsR插入失活，引起生物膜功能性减退，但与201-MI在巨噬细胞内生存能力增强，对细胞、小鼠毒力下降等变化无直接关系。本课题将为后续深入研究胞内生存过程中鼠疫菌功能基因和毒力的变化情况提供借鉴。
鼠疫菌;巨噬细胞;适应性进化;毒力;生物膜
安徽医科大学
硕士
微生物学
宋亚军
2022
中文
R378.61
2022-09-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）