高氧诱导miRNA差异性表达介导新生大鼠肺损伤
目的：支气管肺发育不良是围产医学和新生儿学科关注的重点疾病之一，病理基础是肺泡简单性扩大和肺间隔增厚，高氧是诱发肺损伤的重要因素之一，但导致BPD发生的内在调控机制尚不情况。由于miRNA是真原核生物体内一种短的相对保守的基因序列，能够调控从假腺期到肺泡期的整个肺发育过程，且参与了多种儿童呼吸道疾病，如哮喘、囊性肺纤维化、支气管肺发育不良等。因此，本研究着眼于高氧介导肺损伤过程中miRNA的时间差异性表达，寻找在肺囊状期与肺泡期两个阶段的miRNA差异表达，预测下游靶点，探讨与高氧肺损伤的关系。 方法：70只新生SD大鼠在生后12小时内混合后随机进入P0、P4、P7、P14组，P4、P7、P14再随机分配到高氧、空气亚组。构建高氧诱导新生大鼠肺损伤模型，高氧组大鼠置于封闭的氧箱中，氧箱中持续通入将2L/min的氧气，并监测和维持24h氧浓度为85%-90%，氧箱内产生的CO2用钠石灰吸收。空气组则置于空气中（FiO2：21%），其他条件相同。每24h交换一次母鼠，同时标记小鼠，补充饲料，更换垫料，观察并记录幼鼠的一般生长发育情况，分别在0d、4d，7d，14d收集右肺组织做高通量测序，左肺组织冻存-80℃冰箱待后续验证。再以同样方式造模，取肺组织观察不同组肺组织的形态变化，肺泡发育评价指标采用辐射状肺泡计数（RAC）；根据|FC|＞2，P＜0.001筛选差异性表达的miRNA，miRanda等软件预测靶基因，GO富集和蛋白互作分析关键靶基因及功能；实时荧光定量RT-qPCR验证miR-34a-3p、miR-100-5p、miR-150-5p、miR-34a-5p、miR-21-5p的表达情况； 结果：（1）一般生长发育情况：高氧组的新生SD大鼠自造模第7d开始，相对空气组而言，出现体型偏小，周身干瘦，毛发无光泽，步态不稳，头部颤动等表现。并随着高氧暴露时间的延长，空气组大鼠存活率明显高于高氧组；P4d时，高氧组与空气组大鼠体重无显著差异（P＞0.05）；P7d时，高氧组体重增长较空气组低，差异有统计学意义（P＜0.01），P14d时，两组差异最显著（P＜0.001）；因此随着造模时间延长（P＞4d），相较空气组而言，高氧组体重增长较缓慢，甚至出现降低；（2）肺组织病理形态改变：从P7d起，高氧组中可见明显的增大的肺泡腔，变薄的肺泡壁，增厚的肺泡间隔，及肺泡结构简化，大小不均匀，可见红细胞和炎性细胞渗出，并随暴露时间的延长，变化越显著；（3）肺泡发育评价—辐射状肺泡计数（RAC），P4d时，两组RAC值无差异（P＞0.05）；P7d时，高氧组RAC值小于空气组，差异有意义（P＜0.01）；P14d时，空气组RAC值大于高氧组，差异更显著（P＜0.001）；从P4d起，可见空气组RAC值随着日龄升高，而高氧组不增反降；（4）测序结果显示：P(0-4)d（囊状期），空气组获得106个DEmiRs，高氧组有130个DEmiRs，91个DEmiRs在两组表达，15个、39个只在空气组、高氧组表达；P(4-7)d（肺泡期），高氧组有3个DEmiRs；空气组0个DEmiRs；P(4-14)d（肺泡期），高氧组获得114个DEmiRs；空气组有111个DEmiRs，79个DEmiRs在两组表达，32个在空气组表达，35个在高氧组表达。同时，A4_vs_H4有7个DEmiRs，2个上调，5个下调；A7_vs_H7有16个DEmiRs，7个上调，9个下调；A14_vs_H14有42个DEmiRs，28个上调，14个下调；（5）Venn分析：对A0_vs_A4、H0_vs_H4和A4_vs_H4三个miRNA集比较，P4时，高氧组和空气组共获得7个DEmiRs，5个miRNAs在P0-P4的高氧组中表达，余下2个在P4天时才在高氧组表达；对A4_vs_A7、H4_vs_H7和A7_vs_H7比较得知，在P7时，高氧组和空气组有16个DEmiRs，1个miRNA在P4-P7高氧组表达，15个在P7高氧组中表达；同理，A4_vs_A14、H4_vs_H14和A14_vs_H14，在P14时，共有42个DEmiRs，15个miRNAs三组中共有，10个在P(4-14)d高氧组中表达，3个空气组表达，14个在P14时的高氧组表达；再根据Venn图排除重叠区域的DEmiRs，最后保留表达量超过20的DEmiRs，结合文献，确定了P(0-4)d（囊状期）、P(4-14)d（肺泡期）中参与调节的DEmiRs分别为miR-34a-5p和miR-21-5p；（6）靶基因预测：miR-34a-5p在P(0-4)d期间的靶基因有198个；而miR-21-5p在P(4-14)d期间的靶基因有302个；（7）PPI蛋白互作图：将miR-34a-5p和miR-21-5p的靶基因筛选功能集中区域，miR-34a-5p获得60个靶基因，miR-21-5p获得123个靶基因。因此，miR-34a-5p的靶蛋白主要有Pdgfrb-Pdgfra、Ngfr等。miR-21-5p的靶蛋白主要有Mapk1、Stat3等；（8）GO富集：miR-34a-5p靶蛋白在GO Terms中排序靠前的功能有：参与解剖结构发展、血小板衍生生长因子信号通路、细胞过程及NF-κb信号调节、MAPK激酶调节等。而miR-21-5p的靶蛋白功能集中在决定细胞命运和结合生长因子、细胞活力调节、调控MAPK激酶等方面；（9）实时荧光定量RT-qPCR显示，P14d时，高氧组中miR-34a-3p表达增多，miR-100-5p、miR-150-5p的表达降低，差异有意义（P＜0.001）。miR-34a-5p：P4d时，高氧组较空气组表达量增多，差异有意义（P＜0.05）；高氧组P4d与0d相比，P4d表达增多，差异有意义（P＜0.01），而空气组差别不大（P＞0.05）；miR-21-5p：P14d时，高氧组较空气组升高，差异有意义（P＜0.001）；高氧组P14d比P4d表达增多，差异有意义（P＜0.001），而空气组P14d比P4d表达量下降，差异有意义（P＜0.05）。 结论：高氧诱导新生大鼠肺损伤过程中存在miRNA时间差异性表达。miR-34a-5p和miR-21-5p分别在囊状期和肺泡期表达最显著。miR-34a-5p和miR-21-5p可能是关键调控因子。
新生儿;高氧肺损伤;微小核糖核酸;差异性表达
西南医科大学
硕士
儿科学
董文斌
2022
中文
R563.023
2022-08-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）