基于合成生物学使能技术的微生物天然产物开发
微生物是合成天然产物的“细胞工厂”，能够利用体内的次级代谢网络将羧酸、氨基酸、糖类等小分子底物组装成为复杂多样的终产物，期间涉及大量蛋白酶的精密控制和协同作用。而这些蛋白酶的编码基因往往都是成簇存在的，也就是常说的生物合成基因簇（BGC）。合成生物学使能技术的快速发展促进了理想微生物“细胞工厂”的构建，通过设计改造微生物使之产生特定的天然产物，对微生物天然产物的生物合成途径改造主要涉及BGC的克隆、编辑和表达等。 本文利用和开发前沿的合成生物学使能技术，如酿酒酵母转化偶联重组（TAR）、CRISPR/Cas9基因编辑以及Red/ET重组着眼于微生物天然产物的生产、改造和发现，旨在实现活性天然产物的高效合成、新型天然产物的结构衍生以及未知天然产物的定向挖掘。 林可霉素是一种广谱抗生素，对多种致病菌具有良好的抑制作用。前期研究表明，敲除lmbV基因能够得到含有麦角硫因的林可霉素中间体。为了高效制备林可霉素及其重要中间体，使用CRISPR/Cas9-TAR偶联技术抓取了林可霉素BGC，并敲除了其中的lmbV基因。由此获得的基因簇在StreptomyceslividansTK24和StreptomycescoelicolorM145中进行异源表达。然而，重组菌株的发酵无法产生林可霉素及其中间体。通过RT-PCR实验发现林可霉素BGC在StreptomyceslividansTK24中没有被激活，后续需要尝试过表达正调控基因lmbU来激活相关基因簇。 Sch40832是一种含有二氢咪唑并哌啶核心环的双环类硫肽，具有抗肿瘤活性。目前，对于Sch40832的生物合成机制仍然知之甚少。利用CRISPR/Cas9-TAR偶联技术成功抓取了Sch40832的BGC以便进行后续的一系列遗传操作进一步研究Sch40832的生物合成途径以及相关基因的功能研究。 维里硫酰胺是一种含有特征硫酰胺键和烯基硫醚环的核糖体合成及后修饰肽，具有良好的诱导细胞凋亡活性。目前，对于维里硫酰胺的结构后修饰研究仍然有限。对敲除tvaGS-87和tvaJS-87基因的突变株进行发酵，通过LC-MS检测发酵产物推测维里硫酰胺的后修饰步骤。由于突变株中中间体的累积量太低，无法分离纯化目标化合物并鉴定结构，通过接合转移的方法成功将构建得到的的pJTU2554-?tvaGS-87和pJTU2554-?tvaJS-87成功导入到?tvaGS-87和?tvaJS-87突变株，由此获得的重组菌株能够积累更多的目标化合物，有利于后续开展维里硫酰胺结构修饰反应的生化机制解析。
微生物;天然产物;合成生物学使能技术;林可霉素;维里硫酰胺
上海应用技术大学
硕士
应用化学
刘美娜;刘文
2021
中文
Q938.11
2022-04-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）