超声波预处理改善荞麦球蛋白酶解产物降脂活性的研究
研究发现，过多摄入高脂膳食会引起机体内脂代谢紊乱，从而诱发多种代谢性疾病。目前荞麦蛋白及其活性肽在防治代谢性疾病中的应用已成为研究的热点。但仍存在蛋白酶解不彻底、酶解效率低以及酶解产物活性低等诸多问题，采用适当地预处理对荞麦蛋白进行改性从而改善其酶解效果的研究目前仍鲜有报道。本文以荞麦球蛋白为研究对象，利用超声波预处理技术辅助碱性蛋白酶酶解以获得具有高降脂活性的酶解产物，并通过建立HepG2细胞脂质堆积模型，结合细胞代谢组学技术，从分子水平和代谢水平研究超声波预处理后制备的荞麦球蛋白酶解产物对模型细胞的降脂作用及其作用机制。主要研究结论如下： （1）利用单因素试验和响应面优化试验，得出碱性蛋白酶酶解荞麦球蛋白最佳条件为：加酶量3.37%、pH=10、时间135min和温度50℃。进一步以水解度和酶解产物的胆酸盐吸附率为评价指标，利用超声波预处理荞麦球蛋白，得出最佳条件为：功率300W，作用时间15min。此时荞麦球蛋白的水解度较未超声波处理组提高了14.50%；且酶解产物的胆酸钠和牛磺胆酸钠的结合率分别上升了41.64%、25.10%，由此表明：超声波预处理辅助酶解荞麦球蛋白后能够有效提高蛋白质水解度及酶解产物的胆酸盐吸附能力，从而提高酶解产物降脂活性。 （2）通过油酸诱导建立HepG2细胞脂质堆积模型，相较于单独酶解制得的酶解产物，超声波预处理后制备的酶解产物抑制细胞内脂肪堆积效果更佳，可明显减少细胞内甘油三酯（Triglycerides,TG）、胆固醇（TotalCholesterol,TC）和丙二醛（Malonaldehyde,MDA）含量，较模型组分别减少了51.42%、36.67%和30.15%。油红O染色观察到细胞内脂滴含量变化也与TG含量减少的结果相一致。此外，超声波预处理后所得酶解产物可以有效提高HepG2细胞中超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,SOD）活力水平及总抗氧化能力（TotalAntioxidantCapacity,T-AOC），较模型组分别提高了35.82%和34.93%。且该方法制备的酶解产物对油酸引起细胞氧化损伤的保护作用优于未超声波处理。进一步对细胞中脂代谢基因转录水平和蛋白水平变化的测定，发现超声波预处理制得的荞麦球蛋白酶解产物能通过增强LXRα表达促进细胞内甘油三酯转化，以减少细胞内脂质合成；增强PPARα的表达促进脂肪酸的β-氧化，以增强细胞脂质代谢，并通过抑制SREBP2的表达促进胆固醇的代谢外流，以减少胆固醇在细胞内的蓄积。综上，超声波预处理后再进行酶解比只进行单独酶解制备的产物缓解脂质沉积效果更明显。 （3）利用代谢组学分析手段，由多元统计PLS-DA进行组间比较分析可知：正常组、模型组、未超声组和超声组区分明显，且超声组分布距离正常组较近，表明超声波预处理后制得的荞麦球蛋白酶解产物干预可在一定程度上回调油酸诱导的模型细胞内源性物质改变，使细胞状态向正常转变。筛选出的差异性代谢产物有21种，包括：L-脯氨酸；邻氨基苯甲酸；L-色氨酸；泛酸等。将代谢产物上传到KEGG平台进行代谢通路分析，代谢产物共涉及13条代谢通路，包括色氨酸代谢；泛酸和辅酶A生物合成以及甘油磷脂代谢等。其中贡献值最高的是色氨酸代谢，而涉及产物最多的代谢通路是甘油磷脂代谢。故超声波预处理后制得的荞麦球蛋白酶解产物可通过干预脂质堆积状态细胞内的氨基酸代谢、维生素代谢和磷脂代谢等相关通路来改善细胞的脂代谢异常，发挥其降脂功效。
荞麦蛋白;超声波预处理;酶解产物;降脂活性
上海应用技术大学
硕士
生物化工
周一鸣
2021
中文
TQ464.7
2022-04-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）