积雪草酸通过ROS介导的自噬和凋亡抑制人肝细胞癌细胞体内外增殖的研究
目的： 积雪草酸（asiaticacid，AA）是壮药积雪草（centellaasiatica(L.)Urban）的主要活性成份，具有广谱的抗瘤效应。本研究在明确AA诱导自噬的基础上，围绕活性氧（ROS）与自噬、凋亡的关系进一步研究AA抑制肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）细胞体内外增殖的相关机制，为AA作为抗HCC药物的研究与开发提供理论和实验依据。 方法： 1.不同浓度AA处理人HCC细胞（SMMC-7721、Huh7和HepG2细胞）及MIHA人正常肝细胞24h后，CCK-8法检测AA对细胞活性的影响并计算IC50，比较AA对三种HCC细胞和正常肝细胞增殖的影响，并根据IC50选择SMMC-7721细胞和近似IC50的AA浓度进行后续实验。 2.采用自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）结合激光共聚焦显微镜检测自噬流，AnnexinV-APC/7-AAD双染色法流式细胞术检测凋亡率，WesternBlot检测自噬、凋亡相关蛋白表达，DCFH-DA荧光探针流式细胞术检测ROS水平，观察AA对SMMC-7721细胞自噬、凋亡和ROS水平的影响。 3.CCK-8法检测自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA）、氯喹（chloroquine，CQ）对AA抑制SMMC-7721细胞增殖的影响；并进一步采用AnnexinV-APC/7-AAD双染色法流式细胞术检测细胞凋亡率、WesternBlot检测自噬、凋亡相关蛋白表达，观察AA联合CQ对SMMC-7721细胞自噬和凋亡的影响。 4.采用CCK-8法检测细胞活性，DCFH-DA荧光探针流式细胞术检测ROS水平，自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）结合激光共聚焦显微镜检测自噬流，AnnexinV-APC/7-AAD双染色法流式细胞术检测凋亡率，观察AA联合ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸（N-Acetyl-L-Cysteine，NAC）对SMMC-7721细胞增殖、ROS水平、自噬和凋亡的影响。 5.构建SMMC-7721细胞裸鼠皮下移植瘤模型，将成模裸鼠随机分为4组：Control组、CQ组、AA组和AA+CQ组，每组8只；Control组裸鼠每日灌胃（i.g.）等体积0.5%羧甲基纤维素钠，其余3组裸鼠分别灌胃100mg/kgAA和/或腹腔注射50mg/kgCQ，每日一次，连续给药21天，期间每7天测量裸鼠体重和瘤径。在给药第21天处死裸鼠取瘤块测量瘤重和瘤体积，HE染色法检测瘤块病理组织学改变，WesternBlot法检测瘤块自噬及凋亡相关蛋白改变，从而观察AA联合CQ对SMMC-7721细胞裸鼠移植瘤生长、自噬和凋亡的影响。 结果： 1.与Control组比较，AA浓度依赖性地抑制SMMC-7721、Huh7和HepG2三种人HCC细胞增殖（P＜0.05或P＜0.01），IC50分别为38.19μM、45.62μM和47.86μM，而对MIHA人正常肝细胞增殖无明显影响（P＞0.05）。 2.选用35μMAA处理SMMC-7721细胞24h后，与Control组相比，AA明显提高自噬体（mRFP+GFP黄色斑点）和自噬溶酶体（mRFP红色斑点），与自噬诱导剂雷帕霉素（Rapamycin，RAPA）结果相似；升高LC3-Ⅱ和下调P62蛋白表达，但对LC3-Ⅰ蛋白表达无明显影响；提高SMMC-7721细胞凋亡率；上调Bax、Caspase-3和CytC和下调Bcl-2蛋白表达；升高细胞ROS水平（均P＜0.01）。表明AA可诱导HCC细胞自噬、凋亡和ROS蓄积。 3.与AA组相比，AA+3-MA组尤其是AA+CQ组抑制SMMC-7721细胞增殖的作用明显减弱（均P＜0.05或P＜0.01），表明自噬抑制剂3-MA尤其是CQ可拮抗AA抑制SMMC-7721细胞增殖的作用。进一步观察AA联合CQ对SMMC-7721细胞自噬和凋亡的影响。WesternBlot检测自噬相关蛋白表达结果显示，与Control组相比，CQ上调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例和P62蛋白表达，AA上调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例（P＜0.01）并下调P62蛋白的表达；与AA组比较，AA合用CQ可进一步上调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例和P62蛋白表达（均P＜0.05或P＜0.01）。流式检测细胞凋亡率结果显示，与Control组相比较，CQ和AA均能提高SMMC-7721细胞凋亡率，以AA作用更明显；与AA组比较，合用CQ可减弱AA诱导SMMC-7721细胞凋亡的作用（均P＜0.01）。WesternBlot检测凋亡相关蛋白表达结果显示，与Control组相比，CQ上调Bax蛋白表达而下调Bcl-2表达（均P＜0.01）而对Caspase-3和CytC蛋白的表达无明显影响（均P＞0.05），AA明显上调Bax、Caspase-3和CytC蛋白表达和下调Bcl-2蛋白的表达（均P＜0.01）；与AA组比较，合用CQ可使AA上调Bax、Caspase-3蛋白及下调Bcl-2蛋白的作用明显减弱（均P＜0.05或P＜0.01），但对CytC蛋白的表达无明显影响（P＞0.05）。表明CQ可拮抗AA抑制SMMC-7721细胞增殖及诱导自噬和凋亡的作用。 4.与AA组相比，合用NAC可使AA抑制SMMC-7721细胞增殖、升高ROS水平和提高自噬流、凋亡率的作用明显减弱（均P＜0.05或P＜0.01），表明NAC可拮抗AA抑制SMMC-7721细胞增殖及诱导ROS蓄积、自噬和凋亡的作用。 5.成功构建SMMC-7721裸鼠皮下移植瘤模型。连续给药21天，与Control组相比，CQ组、AA组和AA+CQ组裸鼠体重无明显差异（P＞0.05）但瘤块体积和瘤重明显减小；AA+CQ组瘤块体积及瘤重较AA组明显增加（均P＜0.05或P＜0.01）。HE染色结果显示，给药21天后，与Control组相比，CQ、AA和AA+CQ组瘤块均出现明显的HE染色坏死区，以AA组最明显；合用CQ可减少AA造成的坏死区。WesternBlot检测自噬相关蛋白表达结果显示，给药21天后，与Control组相比，CQ上调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例和P62蛋白表达，AA上调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例和下调P62蛋白表达，与AA组相比，AA联合CQ可进一步上调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例和P62蛋白表达（均P＜0.05或P＜0.01）。WesternBlot测定凋亡相关蛋白结果显示，给药21d后，与Control组相比，CQ和AA均可上调Bax、Caspase-3和CytC蛋白的表达而降低Bcl-2蛋白表达，以AA作用更明显；AA+CQ可拮抗AA上调Bax、Caspase-3和CytC蛋白的作用（均P＜0.05或P＜0.01），而对Bcl-2表达无明显影响（P＞0.05）。表明AA抑制SMMC-7721细胞体内增殖及诱导自噬和凋亡的作用可被CQ拮抗。 结论： AA通过蓄积ROS而诱导抑制性自噬，继而诱导凋亡并最终抑制HCC细胞的体内外增殖。
肝细胞癌;积雪草酸;细胞凋亡;活性氧;自噬作用
广西医科大学
硕士
药理学
何萍
2021
中文
R735.7;R285.6
2022-04-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）