基于TLR4/NF-κB和PI3K/Akt信号通路研究香蜂草苷对小鼠非酒精性脂肪肝的作用及其作用机制
目的 基于TLR4/NF-κB和PI3K/Akt信号通路研究香蜂草苷（didymin）对非酒精性脂肪肝（Non-alcoholfattyliverdisease，NAFLD）小鼠肝脏脂质沉积、氧化应激、炎症反应以及细胞凋亡相关信号通路蛋白及基因的表达的影响，探究didymin对NAFLD小鼠的作用及其作用机制。 方法 1.NAFLD小鼠模型的制备与处置 90只C57BL/6J小鼠随机分成正常对照组、didymin对照组（0.8mg/kg）、模型组、水飞蓟宾（silibinin）阳性对照组（26.25mg/kg）、didymin低、高剂量组（0.4mg/kg、0.8mg/kg），共6组，每组15只。其中模型组、silibinin阳性对照组和didymin低、高剂量组小鼠每天给予腹腔注射地塞米松（Dexamethasone，DEX）（1mg/kg，i.p.）同时联合高脂饲料（HFD/DEX）喂养23天，正常对照组和模型组均予以腹腔注射等体积生理盐水；在第7天确定模型成立后，didymin对照组、silibinin阳性对照组和didymin不同剂量组分别予以相应的药物灌胃干预，而非药物干预组则均以相同给药方式给予等体积生理盐水处理。在第23天最后一次药物干预后，禁止饮食不禁水12小时，各组小鼠摘眼球取血，并取出肝脏组织备用。 2.Didymin对NAFLD小鼠肝脏转氨酶的影响 全自动生化分析仪检测didymin对小鼠血清中谷草转氨酶（Aspartateaminotransferase，AST）、谷丙转氨酶（Alaninetransaminase，ALT）水平的影响；Hamp;E病理学染色观测小鼠肝细胞病理结构变化情况。 3.Didymin对NAFLD小鼠肝脏脂质沉积的影响 全自动生化分析仪检测didymin对小鼠血清总胆固醇（Totalcholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（Highdensitylipoprotein，HDL）和低密度脂蛋白（Lowdensitylipoprotein，LDL）水平的影响，试剂盒检测didymin对小鼠肝组织匀浆游离脂肪酸（Non-esterifiedfattyacid，NEFA）含量的影响。另外，油红O病理学染色观测didymin对小鼠肝细胞脂肪滴生成的影响。 4.Didymin对NAFLD小鼠肝脏脂质代谢相关基因和蛋白的影响 Westernblot法检测小鼠肝组织中ACC1、SREBP-1c、LXRα、FAS蛋白的表达；同时，RT-PCR法检测小鼠肝组织中ACC1、SREBP-1cmRNA的表达。 5.Didymin对NAFLD小鼠氧化应激及脂质过氧化的影响 试剂盒检测小鼠肝组织中髓过氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）、还原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathioneperoxidase，GSH-Px）的含量。 6.Didymin对NAFLD小鼠肝脏炎症反应的影响 ELISA试剂盒检测小鼠肝组织中TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β的含量。同时，Westernblot法测定小鼠肝脏中TNF-α、IL-6蛋白的表达。 7.Didymin对NAFLD小鼠肝细胞凋亡的影响 Westernblot法检测小鼠肝组织中BAX、Bcl-2、Caspase3、Cleavedcaspase3、Caspase8、Cleavedcaspase8、Caspase9、Cleavedcaspase9蛋白的表达。 8.Didymin对NAFLD小鼠肝脏TLR4/NF-κB和PI3K/Akt信号通路基因和蛋白的影响 Westernblot法检测小鼠肝组织中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、P70S6K、p-P70S6K、PTEN、TLR4、NF-κBp65、p-NF-κBp65、p-IKKα/β、IκBα、p-IκBα、MyD88蛋白的表达；RT-PCR法检测小鼠肝组织中Akt、mTOR、NF-κBp65、MyD88mRNA的表达。 结果 1.小鼠非酒精性脂肪肝动物模型的制备 本研究采用腹腔注射地塞米松联合高脂饲料（HFD/DEX）喂养雄性C57BL/6J小鼠共23天，制备NAFLD小鼠模型。结果显示，模型组小鼠血清中TC、TG、LDL、ALT和AST水平均显著上升，HDL水平显著下降；模型组小鼠肝组织匀浆中NEFA水平显著增加。同时，Hamp;E染色和油红O染色结果表明，模型组小鼠肝组织中可见大量脂肪空泡、肝细胞肿胀，呈气球样结构，肝小叶模糊；油红O红染显著增加，表明肝脏组织内有明显的脂肪滴形成并累积。以上结果说明该小鼠模型切合NAFLD的病理学变化特征，提示模型制备成功。 2.Didymin减轻NAFLD小鼠肝损伤 全自动生化仪测定结果呈示，与模型组比较，didymin的干预明显降低了小鼠血清中ALT、AST的水平（P＜0.01）。另外，Hamp;E病理学染色的观测结果提示，didymin可以显著改善肝组织细胞损伤。以上表明，didymin能降低小鼠血清转氨酶的含量，从而缓解肝细胞损伤的病理情况。 3.Didymin减轻NAFLD小鼠肝脏脂质沉积 实验结果发现，didymin的干预能明显减少小鼠血清中TC、TG和LDL的含量（P＜0.01），并显著增加小鼠血清中HDL的含量（P＜0.01）。同时还能显著降低小鼠肝组织匀浆中NEFA的水平（P＜0.01）。此外，油红O病理学染色观测提示，正常对照组和didymin对照组的肝细胞构造正常，几乎没有油红O的着色，说明脂肪很少积聚；而模型组肝脏油红O染色明显更深，说明肝脏内有明显脂肪滴的沉淀；给予silibinin和didymin干预后，脂质积累明显减少。以上结果提示，didymin能有效减少小鼠肝脏脂肪累积，对NAFLD具有显著缓解作用。 4.Didymin调控小鼠肝脏脂质相关基因和蛋白的表达 Westernblot结果显示，didymin显著降低小鼠肝脏中ACC1、SREBP-1c、LXRα和FAS的蛋白表达。此外，RT-PCR分析结果呈示，与模型组相比，didymin治疗组的ACC1和SREBP-1cmRNA的表达水平明显下调。这些结果表明，didymin通过负调控ACC1、SREBP-1c、LXRα和FAS的表达，显著降低了小鼠肝脏脂肪堆积。 5.Didymin减轻NAFLD小鼠肝脏氧化应激和脂质过氧化 结果显示，模型组小鼠肝脏组织中MPO、MDA水平显著上升（P＜0.01），didymin治疗后MDA含量显著下降（P＜0.01）。模型组小鼠肝脏中SOD、GSH、GSH-Px等抗氧化酶活性明显降低（P＜0.01），且didymin能明显逆转这些异常变化（P＜0.01）。以上结果表明，didymin对肝损伤的保护作用可能与抑制脂质过氧化、减轻氧化应激和恢复抗氧化酶有关。 6.Didymin减轻NAFLD小鼠肝脏炎症反应 ELISA试剂盒检测小鼠肝组织中TNF-α、IL-6、IL-10和IL-1β的含量。结果显示，对比正常对照组，模型组小鼠肝组织中TNF-α、IL-1β、IL-6含量明显增加（P＜0.01），IL-10含量显著减少（P＜0.01）。然而，didymin干预后，这些炎症因子的含量显著逆转到正常水平（P＜0.05或P＜0.01）。此外，Westernblot结果显示，模型组小鼠肝组织中IL-6和TNF-α蛋白表达水平明显高于正常对照组（P＜0.01）。然而，didymin干预后显著降低了IL-6和TNF-α的表达水平（P＜0.01）。上述结果表明，didymin能减少小鼠肝脏细胞炎症因子分泌，从而减轻小鼠肝脏炎症反应。 7.Didymin抑制NAFLD小鼠肝细胞凋亡 Westernblot分析表明，相比正常对照组，模型组小鼠肝组织中BAX的蛋白表达水平显著上升（P＜0.01），而Bcl-2的蛋白表达水平显著下降（P＜0.01）。为了进一步解释小鼠肝细胞的凋亡反应，我们还检测了Cleavedcaspase9、Cleavedcaspase8和Cleavedcaspase3家族蛋白；结果显示，模型组小鼠肝组织中上述蛋白的表达显著上升（P＜0.01）。经didymin干预处理后，这些凋亡相关蛋白的异常表达明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。上述结果表明，didymin通过调控Caspase和Bcl-2家族蛋白，抑制NAFLD小鼠肝细胞凋亡。 8.Didymin抑制NAFLD小鼠肝脏TLR4/NF-κB和PI3K/Akt信号通路 Westernblot分析表明，相比正常对照组，模型组小鼠肝组织中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K、TLR4、p-NF-κBp65、p-IKKα/β、p-IκBα和MyD88蛋白表达水平显著上调（P＜0.01），而PTEN蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。Didymin干预后，这些异常表达的蛋白得到了显著的逆转（P＜0.05或P＜0.01）。RT-PCR分析数据表明，相比正常对照组，模型组小鼠肝组织中Akt、mTOR、TLR4、p-NF-κBp65和MyD88mRNA的表达水平显著上调（P＜0.01），给予didymin干预后，这些基因表达水平得到显著下调（P＜0.01）。以上实验结果提示，didymin能通过调控TLR4/NF-κB和PI3K/Akt信号通路减轻小鼠NAFLD。 结论 Didymin能明显减轻HFD/DEX诱导的小鼠肝脏脂肪变性和肝细胞损伤，其作用机制可能是didymin通过调控TLR4/NF-κB和PI3K/Akt信号通路相关基因和蛋白的表达，进而减轻小鼠肝脏氧化应激、增强抗氧化防御系统、减轻炎症反应和抑制肝细胞凋亡。
香蜂草苷;非酒精性脂肪肝;脂质沉积;TLR4/NF-κB信号通路;PI3K/Akt信号通路
广西医科大学
硕士
药理学
韦锦斌
2021
中文
R285
2022-04-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）