桦木酸靶向脂质体的制备及其对肝癌细胞体外靶向作用研究
目的：制备由透明质酸（hyaluronicacid，HA）修饰的桦木酸脂质体（HA-BA-L），并对其进行表征鉴定，研究其对肝癌细胞增殖的抑制作用以及体外靶向作用。 方法： 1.桦木酸脂质体（BA-L）处方前研究：建立高效液相色谱法（HPLC）检测桦木酸（betulinicacid，BA）含量，进行专属性、精密度、重复性和加样回收率等方法学考察；通过揺瓶法检测BA的油水分配系数；采用低速离心法测定脂质体的包封率。 2.BA-L的处方优化：（1）通过薄膜分散法、乙醇注入法和主动载药法制备BA-L，以包封率、粒径及PDI为评价指标，筛选制备BA-L的最优方法。（2）采用最优方法制备BA-L，通过单因素实验和响应面设计实验优化BA-L处方，筛选最佳BA-L处方，并进行处方验证，考察其粒径、PDI及电位；采用低速离心法测定BA-L的包封率和载药量。（3）考察BA-L在PBS溶液、血清和细胞完全培养基三种模拟体外介质中粒径和PDI的稳定性，并考察BA-L在室温下和4℃条件下的稳定性。 3.HA-BA-L的制备：（1）在BA-L最优处方的基础上，采用乙醇注入法制备载有十八胺的BA-L，利用静电结合原理将HA修饰在载有十八胺的BA-L表面制备HA-BA-L，考察其粒径、PDI及电位；并测定HA-BA-L的包封率和载药量。（2）考察HA-BA-L在室温下和4℃条件下的泄漏率；通过体外溶血实验考察HA-BA-L的溶血性；体外透析法考察HA-BA-L在不同pH值的释放介质中的释药特征。 4.HA-BA-L的体外抗肝癌效果研究：（1）采用噻唑蓝（MTT）法分别评价BA、BA-L和HA-BA-L对体外LO2人正常肝细胞、HepG2肝癌细胞和SMMC-7721肝癌细胞增殖的抑制作用，并考察脂质体辅料对HepG2、SMMC-7721肝癌细胞活性的影响。（2）分别通过BA、BA-L和HA-BA-L处理肝癌细胞，观察肝癌细胞集落形成和迁移情况；检测肝癌细胞活性氧、总抗氧化能力及培养液中乳酸脱氢酶（LDH）、谷草转氨酶（AST）的活性。通过比较BA、BA-L和HA-BA-L对肝癌细胞状态指标的影响，探析HA-BA-L的抗肝癌效果。 5.HA-BA-L的体外靶向效果与机制研究：（1）选用荧光染料罗丹明B（RHB）载入脂质体培养HepG2肝癌细胞细胞，在荧光显微镜下观察HepG2肝癌细胞对靶向荧光脂质体（RHB-HA-L）和非靶向荧光脂质体（RHB-L）的摄取情况。（2）以每毫克细胞蛋白摄取的荧光值为指标来评价HepG2肝癌细胞对RHB-L和RHB-HA-L的摄取。（3）通过加入竞争性抑制剂（游离HA）封闭HA受体，在荧光显微镜下观察HepG2肝癌细胞对RHB-HA-L的摄取情况，并用荧光分光光度法检测其摄取量。（4）通过免疫组化法分别观察BA、BA-L和HA-BA-L对HepG2肝癌细胞表面CD44表达的影响，再结合荧光脂质体的摄取率验证HA-BA-L对HepG2肝癌细胞的靶向作用。（5）分别采用BA、BA-L和HA-BA-L孵育HepG2肝癌细胞，通过蛋白免疫印迹（WesternBlot,WB）检测各组HepG2肝癌细胞ROCK1、IP3和RAS蛋白的表达，分析HA-BA-L对HepG2肝癌细胞靶向治疗的可能机制。 结果： 1.BA-L处方前研究：采用HPLC法测定BA含量，BA浓度与峰面积在10-320μg/mL浓度范围内线性关系良好（r＝0.9999），仪器的精密度、重复性、加样回收率结果均符合方法学要求；BA的油水分配系数logP值为2.45±0.20，适合制备脂质体制剂；15min低速离心（3000r/min）法可有效测定BA-L的包封率。 2.BA-L的处方优化：（1）由薄膜分散法、乙醇注入法和主动载药法所制备BA-L的包封率分别为68.5%、75.3%和47.9%；粒径分别为321.2nm、175.6nm和279.7nm；PDI分别为0.55、0.15和0.30。乙醇注入法制备的BA-L在包封率和粒径方面比薄膜分散法和主动载药法有优势，本研究采用该方法制备脂质体进行后续研究。（2）通过响应面得出最优处方与制备工艺如下：蛋黄卵磷脂与胆固醇质量比为10:1、蛋黄卵磷脂与BA质量比为8:1、4mL乙醇、8mL磷酸缓冲盐（PBS，pH7.4）和制备温度53℃。由优化处方制备的BA-L平均包封率为84.62%，平均载药量为10.70%，平均粒径为135.7nm，平均电位为-13.7mV，平均分散系数（PDI）为0.22。（3）BA-L的粒径在PBS溶液、血清和细胞完全培养基中表现稳定，48h时均小于150nm；4℃储存15d稳定性良好。 3.HA-BA-L的制备：（1）通过静电结合原理制备的HA-BA-L平均粒径为155.4nm，PDI为0.25，平均电位为-18.2mV，平均包封率为83.13%，平均载药量为9.62%。（2）HA-BA-L在4℃贮存15d稳定性良好；溶血实验表明HA-BA-L无溶血现象，生物相容性良好；考察HA-BA-L的体外释放效果，发现在1h时HA-BA-L在释放介质pH为6.5时释放度优于在pH为7.4的释放介质，且没有突释情况。 4.HA-BA-L的体外抗肝癌效果研究：（1）脂质体辅料对HepG2、SMMC-7721肝癌细胞活性没有影响；BA、BA-L和HA-BA-L对LO2正常肝细胞活性没有抑制作用；BA、BA-L和HA-BA-L对HepG2肝癌细胞和SMMC-7721肝癌细胞的增殖抑制作用呈浓度和时间依赖性，且HA-BA-L对HepG2、SMMC-7721肝癌细胞的增殖抑制作用强于BA-L和BA。（2）BA、BA-L和HA-BA-L能抑制HepG2、SMMC-7721肝癌细胞集落的产生，能抑制HepG2肝癌细胞的迁移以及增加HepG2肝癌细胞培养液中LDH和AST的活性，并增加HepG2肝癌细胞的活性氧及总抗氧化能力。 5.HA-BA-L的体外靶向机制研究：（1）在荧光显微镜下观察HepG2肝癌细胞对RHB-HA-L的摄取荧光强度显著高于RHB-L的摄取荧光强度。（2）HepG2肝癌细胞在12h和24h对RHB-HA-L的摄取率分别是RHB-L的1.69倍和2.75倍，显示具有靶向片段的RHB-HA-L能够主动靶向作用于HepG2肝癌细胞，进而显著提高HepG2肝癌细胞对RHB-HA-L的摄取。（3）通过加入竞争性抑制剂（游离HA）封闭HepG2肝癌细胞表面HA受体，HepG2肝癌细胞对RHB-HA-L摄取量显著降低，进一步验证了RHB-HA-L能够主动靶向于HepG2肝癌细胞表面HA受体。（4）免疫组化结果显示，与BA-L组比较，HA-BA-L组HepG2肝癌细胞CD44表达降低，可能是HA-BA-L被分布在HepG2肝癌细胞CD44受体识别后并结合，印证了HA-BA-L通过CD44靶向作用于HepG2肝癌细胞。（5）WB结果显示BA、BA-L和HA-BA-L均可下调HepG2肝癌细胞ROCK1、IP3和RAS蛋白的表达，且HA-BA-L组肝癌细胞ROCK1、IP3和RAS蛋白表达水平显著低于BA和BA-L组，提示CD44下游信号通路ROCK1-IP3-RAS的下调可能是HA-BA-L靶向抑制HepG2肝癌细胞增殖的效果表现。 结论： 1.本实验采用乙醇注入法制备BA-L，接载十八胺后通过静电结合原理制备HA-BA-L，粒径为155.4nm，电位为-18.2mV，PDI为0.25，包封率为83.13%。 2.HA-BA-L对HepG2肝癌细胞具有明显的靶向抑制作用，CD44是HA-BA-L发挥靶向作用的重要受体蛋白，其靶向作用可能是通过ROCK1-IP3-RAS通路抑制肝癌细胞增殖，从而起到靶向抗肝癌作用。
桦木酸;脂质体;透明质酸;肝癌;增殖抑制
广西医科大学
硕士
药剂学
黄建春
2021
中文
R282.71
2022-04-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）