蒽醌修饰物的设计合成及抗肿瘤活性研究
目的： 以激活内质网应激为目标，设计合成含1,8-二苄氧基-9,10-蒽醌-3-甲酰胺结构特征系列蒽醌修饰物，评价各蒽醌修饰物体外抗肿瘤活性，并探究蒽醌修饰物4c杀伤肝癌细胞的作用机制，为设计和开发通过内质网应激介导肿瘤细胞死亡的蒽醌类抗肿瘤药物提供理论依据。 方法： （1）以大黄酸为原料，通过取代、水解、酰化和缩合反应合成系列蒽醌修饰物，通过1HNMR、13CNMR和HRMS进行结构表征； （2）MTT法测定蒽醌修饰物对肝癌细胞(HepG2)、卵巢癌细胞(A2780、SKOV-3)、肺癌细胞(A549)的增殖抑制作用； （3）选择肝癌细胞(HepG2)为研究对象，蒽醌修饰物4c为受试化合物；通过HE染色结合光学显微镜观察细胞形态学改变；ERTracker和Hoechst33342染色法结合激光共聚焦观察内质网的变化；透射电子显微镜观察细胞超微结构；流式细胞术检测细胞凋亡情况；WesternBlotting法检测内质网应激相关蛋白Bip、PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF6、IRE1，内质网应激介导凋亡的关键蛋白CHOP和自噬关键蛋白LC3、p62的表达水平。stubRFP-sensGFP-LC3双荧光慢病毒检测HepG2细胞的自噬流变化。 结果： （1）成功合成了含1,8-二苄氧基-9,10-蒽醌-3-甲酰胺结构特征系列蒽醌修饰物16个，所有化合物结构均经1HNMR、13CNMR、HRMS确证。 （2）MTT检测结果表明，合成的修饰物除4j外，对肝癌细胞株HepG2，卵巢癌细胞株SKOV-3、A2780和肺癌细胞株A549都具有较好的抑制活性，其IC50均明显低于先导化合物大黄酸；甲酰胺侧链N末端含氮取代基修饰物4b对四种肿瘤细胞的抑制率最强，IC50均低于2.50μM；而含氮取代基为苯胺的修饰物4j对四种肿瘤细胞的抑制活性最差，IC50均大于100μM。光镜下发现，大部分蒽醌修饰物均诱导细胞产生空泡，其中4l,4m，4n对四株肿瘤细胞均能产生空泡。 （3）HE染色结合光学显微镜观察到蒽醌修饰物4c以4μM作用于HepG2细胞12h后引起细胞质空泡化，作用时间延长，细胞数明显减少，在48h后，可观察到细胞皱缩，大量胞浆液流失 （4）ERTracker和Hoechst33342染色法结合激光共聚焦观察到蒽醌修饰物4c以2μM作用于HepG2细胞后，ER-TrackerRed特异性标记中出现空泡，表明空泡来源于内质网。 （5）透射电镜观察到蒽醌修饰物4c以4μM作用于HepG2细胞后，细胞体积缩小，细胞膜表面突触减少或消失，内质网、高尔基体肿胀、扩张，形成大量胞浆空泡，线粒体水肿、脊消失，细胞核固缩，染色质边集，胞浆中大量细胞器溶解变性，细胞质内可见明显凋亡小体形成。表明蒽醌修饰物4c可引起肝癌细胞内质网损伤并诱导细胞凋亡。 （6）流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示，蒽醌修饰物4c处理HepG2细胞后引起的凋亡率呈浓度依赖性增加，8μM的浓度组凋亡率达到79.21%，高于凋亡诱导剂10μM顺铂组的凋亡率53.65%。 （7）WesternBlot法检测结果表明，与空白对照组相比，蒽醌修饰物4c以4μM作用于HepG2细胞后，可上调内质网应激蛋白Bip和ATF6的表达水平，而PERK和IRE1信号通路的蛋白未见明显的变化，内质网应激介导凋亡的关键蛋白CHOP表达水平上调，凋亡相关蛋白PARP剪切型表达增加，自噬关键蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加，但P62的表达水平未下调。提示蒽醌修饰物4c激活内质网应激的ATF6信号通路，诱导细胞凋亡。 （8）自噬流结果表明，HepG2加入蒽醌修饰物4c、自噬抑制剂氯喹和自噬激活剂雷帕霉素后，黄色斑点的数量均多于空白对照组细胞；而加入雷帕霉素的细胞，除了黄色斑点增加，红色荧光斑点也显著增加。提示蒽醌修饰物4c处理的细胞未发生自噬性死亡。 结论： （1）成功合成的系列蒽醌修饰物。 （2）蒽醌修饰物对肝癌细胞株HepG2，卵巢癌细胞株SKOV-3、A2780和肺癌细胞株A549均有一定的抑制活性，大多数蒽醌修饰物可不同程度的激活内质网应激。 （3）在C-3位侧链进行结构修饰，其末端氮原子上取代基数目、含氮杂环类型、碳链长度、支链数目等可影响修饰物对肿瘤细胞的增殖抑制活性。 （4）蒽醌修饰物4c通过激活ATF6信号通路，导致HepG2细胞内质网、线粒体损伤，诱导细胞凋亡。
蒽醌修饰物;设计合成;抗肿瘤活性;内质网应激;细胞凋亡
广西医科大学
硕士
药物化学
侯华新
2020
中文
R914
2022-04-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）