SPON1在锰致神经炎症中的作用及其机制
背景和目的 探索不同浓度锰暴露对神经组织和细胞中SPON1及其炎症通路蛋白的影响，并进一步研究SPON1诱导炎症通路在锰致神经炎症中的作用。 方法 SPF级雄性C57BL/6小鼠32只随机分为对照组、25、50和100mg/kg组，每天灌胃染锰，持续3个月。通过Westernblot和ELISA等实验技术检测亚慢性染锰小鼠皮层和海马中SPON1、ERK1/2/NF-κB通路蛋白的表达水平，以及海马和血浆中炎症因子的表达水平。通过MTT、SRB、LDH检测不同浓度锰暴露对BV2和N2a细胞毒性的影响，根据三个实验结果选定0、25、50、100μMMn2+为BV2细胞锰染毒浓度，0、100、200、400μMMn2+为N2a细胞锰染毒浓度。小鼠神经元染锰浓度参考相关文献选定0、100、200、400μMMn2+。Westernblot和ELISA检测不同浓度锰暴露后体外小鼠原代神经元、BV2和N2a细胞中SPON1、ERK1/2/NF-κB通路相关蛋白及炎症因子的表达情况。根据以上实验结果构建SPON1慢病毒基因过表达和基因敲降稳转BV2细胞，染锰组浓度选定最高浓度100μMMn2+。qRT-PCR检测锰暴露后SPON1过表达或敲降的BV2细胞中SPON1mRNA水平。Westernblot和ELISA检测SPON1过表达或敲降的BV2细胞锰染毒24小时后SPON1、ERK1/2/NF-κB通路相关蛋白及炎症因子的表达情况。数据处理使用SPSS25.0软件，文中图表分析数据多以“平均值±标准差”的形式表示。当多组之间的实验数据方差相等时，使用单向方差分析，两组之间的比较采用最小有效差方法（LSD）。方差不齐时采用秩和检验，若总体分布不全相同，再进行组间两两比较（Kruskal-Wallis），以上检验水准为α=0.05。 结果 1.动物试验结果显示：在小鼠海马中，不同染锰组SPON1蛋白水平及炎症因子表达水平无变化；在小鼠皮层中，当染锰浓度高于50mg/kg时，SPON1蛋白水平下降（P＜0.05）。与对照组比较，小鼠皮层中p-ERK1/2蛋白表达水平增加（P＜0.05）；当染锰浓度高于50mg/kg时，p-NF-κB(p65)的蛋白表达水平增加（P＜0.05）。小鼠原代神经元细胞实验结果显示：在小鼠原代海马神经元中，不同染锰组SPON1蛋白水平无变化。在小鼠原代皮层神经元中，当染锰浓度高于200μM时，SPON1蛋白水平下降（P＜0.05）。 2.经不同浓度锰暴露24h，Bv2细胞和N2a细胞存活率下降。MTT结果显示：与对照组相比，染锰浓度高于150μM的Bv2细胞存活率下降（P＜0.001）；与对照组相比，染锰浓度高于300μM的N2a细胞存活率下降（P＜0.001）。SRB结果显示：与对照组相比，染锰浓度高于150μM的Bv2细胞存活率下降（P＜0.05）;与对照组相比，染锰浓度高于600μM的N2a细胞存活率下降（P＜0.05）。LDH结果显示：与对照组相比，染锰浓度大于等于100μM的Bv2细胞LDH含量增加（P＜0.05）；与对照组相比，染锰浓度大于等于400μM的N2a细胞LDH含量增加（P＜0.001）。 3.锰暴露后BV2细胞和N2a细胞中SPON1蛋白的表达水平降低。在BV2细胞中，当染锰浓度大于等于50μM时，SPON1蛋白表达水平降低（P＜0.05）。在N2a细胞中，当染锰浓度大于等于100μM时，SPON1蛋白表达水平降低（P＜0.001）。 4.锰暴露会增加BV2细胞和N2a细胞中ERK1/2、p-ERK1/2、p-NF-κB(p65)蛋白的水平。在BV2细胞中，NF-κB(p65)蛋白水平的变化无统计学意义，当染锰浓度大于等于50μM时，ERK1/2蛋白和p-NF-κB(p65)蛋白表达水平增加（P＜0.05），当染锰浓度大于等于25μM时，p-ERK1/2蛋白水平增加（P＜0.05）。在N2a细胞中，NF-κB(p65)蛋白水平的变化无统计学意义，400μMMn2+组的ERK1/2蛋白水平增加（P＜0.05），当染锰浓度大于等于100μM时，p-NF-κB(p65)蛋白和p-ERK1/2蛋白水平增加（P＜0.05）。 5.在Bv2细胞中，100μM锰暴露增加了细胞中ROS水平（P＜0.05）；在N2a细胞中，400μM锰暴露增加了细胞中ROS水平（P＜0.05）。与对照组相比，BV2细胞中100μMMn2+组的IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白水平增加（P＜0.01）。 6.qRT-PCR结果显示：与SPON1shRNA空载组相比，SPON1shRNA1BV2细胞、SPON1shRNA2BV2细胞和SPON1shRNA3BV2细胞组SPON1mRNA水平分别下降（P＜0.05）；与SPON1OE空载组（Vector）相比，SPON1OEBV2细胞组SPON1mRNA水平显著增加（P＜0.05）。WB结果显示：与空载对照组相比，SPON1shRNABV2细胞中SPON1表达下降，p-ERK1/2、p-NF-κB(p65)蛋白的表达水平增加，ERK1/2、NF-κB(p65)蛋白水平无变化；与空载对照组相比，SPON1OEBV2细胞中SPON1表达增加，p-ERK1/2、p-NF-κB(p65)蛋白的表达水平下降，ERK1/2、NF-κB(p65)蛋白水平无变化。 7.SPON1敲降的BV2细胞结果显示：与空载对照组相比，空载对照+锰组和SPON1敲降的BV2细胞中0μM、100μMMn2+组的IL-1β蛋白水平增加；与空载对照+锰组相比，SPON1shRNA1BV2细胞中100μMMn2+组的IL-1β蛋白水平下降，而SPON1shRNA2BV2细胞和SPON1shRNA3BV2细胞中100μMMn2+组的IL-1β蛋白水平增加（P＜0.01）。与对照组相比，空载对照+锰组和SPON1敲降的BV2细胞中100μM组的IL-6蛋白水平增加（P＜0.01）；与空载对照+锰组相比，SPON1shRNA1BV2细胞中100μMMn2+组的IL-6蛋白水平下降（P＜0.01），而SPON1shRNA2BV2细胞和SPON1shRNA3BV2细胞中100μMMn2+组的IL-6蛋白水平增加（P＜0.01）。与空载对照+锰组相比，SPON1shRNA1BV2细胞和SPON1shRNA3BV2细胞中100μMMn2+组的TNF-α蛋白水平增加（P＜0.01）。 8.SPON1过表达的BV2细胞结果显示：与空载对照组相比，空载对照+锰组的IL-1β蛋白水平增加（P＜0.05），SPON1过表达的BV2细胞中0μM组的IL-1β蛋白水平下降（P＜0.05），而SPON1过表达的BV2细胞中100μMMn2+组的IL-1β蛋白水平变化无统计学意义；与空载对照组相比，空载对照+锰组的IL-6蛋白水平增加（P＜0.05），SPON1过表达的BV2细胞中0μM组和100μMMn2+组的IL-6蛋白水平下降（P＜0.05）；与空载对照组相比，SPON1过表达的BV2细胞中0μM组和100μMMn2+组的TNF-α蛋白水平下降（P＜0.05）。 结论 1.SPON1和ERK1/2/NF-κB通路相关蛋白在锰暴露后的不同组织和细胞中呈差异表达。 2.锰暴露通过抑制SPON1的表达影响ERK1/2/NF-κB通路相关蛋白的表达水平以及炎症因子的表达水平，从而促进了神经炎症的发生。
锰;SPON1;神经炎症;炎症因子;海马神经元
广西医科大学
硕士
卫生毒理学
邹云锋
2021
中文
R995
2022-04-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）