PP2Ac调控脂质自噬在苯并芘促进肝细胞脂质沉积中的作用
目的：近年来非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）发病快速增长，已成为我国第一大慢性肝脏疾病，环境内分泌干扰物日常暴露可能是NAFLD的促进因素。苯并[a]芘（BaP）是常见环境污染物，可干扰细胞脂代谢，但低剂量BaP暴露是否能诱导肝细胞脂质沉积，从而促进NAFLD发生，目前尚未知晓。本研究通过构建低剂量BaP暴露的小鼠原代肝细胞模型，研究体外低剂量BaP暴露对肝细胞脂质沉积的影响及其作用机制，为深入理解环境化学污染物对NAFLD的贡献及其作用机制提供线索，为NAFLD的预防和治疗提供有价值的科学依据。 方法：1.小鼠原代肝细胞分离及鉴定 使用2步灌注法分离原代肝细胞，使用差速离心法提纯原代肝细胞。通过形态学观察和PAS糖原染色鉴定原代肝实质细胞。 2.原代肝细胞脂质沉积的检测 使用油红O染色观察细胞内脂滴沉积情况并拍照，使用图像分析软件imageJ分析红染脂滴面积；甘油三酯(TG)含量试剂盒检测BaP暴露后细胞内TG含量变化。 3.原代肝细胞内脂肪酸合成与分解关键基因检测 实时荧光定量PCR检测脂肪酸从头合成关键基因LXR-α、FANS,脂质摄取关键基因FABP1、FATP2，脂肪酸β-氧化关键基因CPT1a、CPT2及脂蛋白合成关键基因DGAT1表达。 4.原代肝细胞mTOR通路及脂质自噬的检测 实时荧光定量PCR检测脂质自噬标志物SIRT1的mRNA表达；蛋白免疫印迹实验检测mTOR、磷酸化mTOR及自噬标志蛋白Atg5、p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达。 5.原代肝细胞PP2Ac甲基化状态以及调控其甲基化相关酶的检测 蛋白免疫印迹实验检测原代肝细胞总PP2Ac、甲基化PP2Ac、去甲基化PP2Ac，以及调控PP2Ac甲基化的酶LCMT1、调控去甲基化的酶PME蛋白表达。 结果：1.小鼠原代肝细胞分离及鉴定 细胞贴壁良好，包膜清晰，细胞未见皱缩。可见被染成蓝紫色的糖原小圆点散在均匀分布于贴壁后的原代细胞胞质内，原代肝细胞纯度＞90%。 2.BaP处理小鼠原代肝细胞活性测定 原代肝细胞经0，0.001，0.01，0.1，1nmol/L的BaP处理72h后，各组细胞贴壁良好，包膜清晰，细胞未见皱缩。除BaP处理后的细胞内可见明显脂肪空泡外，各组细胞形态均未发生明显改变。台盼蓝染色结果显示各剂量组肝细胞活性均在97％以上。选择该剂量范围及处理时间进行后续研究。 3.BaP暴露促进原代肝细胞脂质沉积的检测 原代肝细胞经0，0.001，0.01，0.1，1nmol/LBaP处理后，与对照组比较，随BaP浓度增加，细胞内被油红O染色的脂滴逐渐增加。细胞TG含量逐渐增加，P＜0.05，差异具有统计学意义。 4.低剂量BaP暴露对肝细胞脂肪代谢关键基因表达的影响 原代肝细胞经0，0.001，0.01，0.1，1nmol/LBaP处理后，与对照组比较，调控脂质从头合成的关键基因LXR-α、FASN，调控脂质摄取的关键基因FABP1、FATP2和调控脂蛋白合成的关键基因DGAT1的mRNA表达均未有显著改变，调控脂肪酸β-氧化的关键酶CPT1a和CPT2的mRNA表达增加，P＜0.05，差异有统计学差异。 5.低剂量BaP暴露促进原代肝细胞脂质沉积过程中抑制脂质自噬 原代肝细胞经0，0.001，0.01，0.1，1nmol/LBaP处理后，SIRT1的mRNA表达下降，Atg5蛋白表达下降，p62、LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达量增加，P＜0.05，差异有统计学差异。 6.低剂量BaP通过mTOR通路抑制脂质自噬促进脂质沉积 mTOR通路抑制剂雷帕霉素(rapamycin)干预增加脂质自噬，缓解BaP暴露促进原代肝细胞脂质沉积：(1)rapamycin与0，0.001，0.01，0.1，1nmol/LBaP共孵育后，mTOR、pmTOR蛋白表达降低，SIRT1的mRNA表达增加，Atg5蛋白表达升高，p62、LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达量降低，P＜0.05，差异有统计学意义。（2）rapamycin与0，0.001，0.01，0.1，1nmol/LBaP共孵育后，细胞内被油红O染色的脂滴减少，细胞内TG含量减少。P＜0.05，差异具有统计学意义。 7.低剂量BaP调控PP2Ac及其甲基化水平 BaP暴露促进原代肝细胞脂质沉积过程中，PP2Ac及其甲基化状态的检测结果显示，原代肝细胞经0，0.001，0.01，0.1，1nmol/LBaP处理后，总PP2Ac、甲基化PP2Ac、LCMT1蛋白表达增加，去甲基化PP2Ac、PME蛋白表达降低，P＜0.05，差异具有统计学意义。 8.低剂量BaP通过PP2Ac激活mTOR通路抑制脂质自噬促进脂质沉积 PP2Ac抑制剂OA干预增加脂质自噬通量，缓解BaP暴露促进原代肝细胞脂质沉积：（1）OA与低剂量BaP共孵育后，总PP2Ac、甲基化PP2Ac、LCMT1蛋白表达降低，去甲基化PP2Ac、PME蛋白表达增加，P＜0.05，差异具有统计学意义。（2）OA与低剂量BaP共孵育后，mTOR、pmTOR蛋白表达降低，SIRT1的mRNA表达增加，Atg5蛋白表达升高，p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达量降低，P＜0.05，差异有统计学意义。（3）OA与低剂量BaP共孵育后，细胞内被油红O染色的脂滴减少，细胞内TG含量减少。P＜0.05，差异具有统计学意义。 结论：1.低剂量BaP暴露促进小鼠原代肝细胞脂质沉积。 2.低剂量BaP调控PP2Ac激活mTOR抑制脂质自噬是低剂量BaP促进小鼠原代肝细胞脂质沉积的机制。
非酒精性脂肪性肝病;苯并芘;PP2Ac;mTOR;脂质自噬
广西医科大学
硕士
营养与食品卫生学
李习艺
2021
中文
R575.5
2022-04-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）