岩黄连总碱对Pg-LPS诱导的巨噬细胞焦亡的影响
目的：探究岩黄连总碱（CorydalisSaxicolaBuntingTotalAlkaloid,CSBTA）对巨噬细胞焦亡的影响，并探究其可能的作用机制，为中药辅助牙周炎的治疗提供一定的理论依据。 方法：1.使用佛波酯（PhorbolEster,PMA）诱导人髓系白血病单核细胞（HumanMyeloidLeukemiaMononuclearCells,THP-1细胞），通过倒置显微镜观察细胞形态，流式细胞术检测细胞表面标记物CD14、CD11b的表达水平，鉴定THP-1细胞是否成功被诱导为巨噬细胞。 2.向巨噬细胞中加入1μg/mL牙龈卟啉单胞菌脂多糖（PorphyromonasGingivalis-lipopolysaccharide,Pg–LPS）诱导24h和5mM三磷酸腺苷（Adenosine-triphosphate,ATP）诱导30min。设置实验分组为：①对照组；②焦亡模型组（1μg/mLPg–LPS+5mMATP）。使用扫描电镜观察细胞形态的变化；通过倒置荧光显微镜检测细胞焦亡率的变化；采用RT-qPCR检测细胞焦亡相关因子NLRP3、caspase-1、GSDMDmRNA的表达水平；使用ELISA检测炎症因子IL-1β和IL-18的分泌量；通过WesternBlot检测细胞焦亡相关因子NLRP3、cleave-caspase-1、cleave-GSDMD的蛋白表达水平。通过上述方法，鉴定是否成功建立巨噬细胞焦亡模型。 3.通过CCK8试剂盒检测在浓度为2.5mg/L、5mg/L、10mg/L的岩黄连总碱干预24h后，巨噬细胞的相对存活率，筛选出对巨噬细胞焦亡可以发挥最佳抑制作用的岩黄连总碱的工作浓度，进行后续的实验研究。 4.将岩黄连总碱加入至巨噬细胞的焦亡模型中进行干预。设置实验分组为：①焦亡模型组（1μg/mLPg–LPS+5mMATP）；②阴性对照组（DMSO+1μg/mLPg–LPS+5mMATP）；③岩黄连总碱组（CSBTA+1μg/mLPg–LPS+5mMATP）；④阳性对照组（Ac-YVAD-cmk+1μg/mLPg–LPS+5mMATP）。使用RT-qPCR检测细胞焦亡相关因子NLRP3、caspase-1、GSDMDmRNA的表达量；采用ELISA检测炎症因子IL-1β和IL-18的表达；通过WesternBlot检测细胞焦亡相关因子NLRP3、cleave-caspase-1、cleave-GSDMD的蛋白表达水平。通过上述方法，检测岩黄连总碱对巨噬细胞焦亡的影响。 结果：1.THP-1细胞被含有50ng/mL的PMA的DMEM完全培养基诱导48h后，细胞由悬浮状态变为贴壁状态、形态由球形变为梭形等不规则形状，细胞表面光滑、边界清晰，未见明显触角。同时，流式细胞术检测巨噬细胞的表面蛋白CD14、CD11b的表达量较THP-1细胞明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 2.扫描电镜发现对照组中的巨噬细胞形态多呈梭形，体积相对较小，而焦亡模型组中的巨噬细胞明显肿胀、膨大、细胞膜破裂，细胞表面有胞浆突起。倒置荧光显微镜检测发现焦亡模型组中巨噬细胞焦亡率显著高于对照组（P＜0.05）；细胞焦亡相关因子NLRP3、caspase-1、GSDMDmRNA在焦亡模型组中的表达量显著高于其在对照组中的表达量（P＜0.05）；炎症因子IL-1β和IL-18在焦亡模型组中的表达量显著高于其在对照组中的表达量（P＜0.05）；细胞焦亡相关蛋白NLRP3、cleave-caspase-1、cleave-GSDMD在焦亡模型组中的表达量较其在对照组明显升高（P＜0.05）。 3.CCK8检测发现在浓度为2.5mg/L、5mg/L、10mg/L的岩黄连总碱干预24h后，巨噬细胞的相对存活率较焦亡模型组明显升高（P＜0.05）。其中，当岩黄连总碱浓度为5mg/L时，巨噬细胞的相对存活率最高。 4.岩黄连总碱对巨噬细胞焦亡干预24h后，可以发现：①与焦亡模型组相比，巨噬细胞的焦亡率在岩黄连总碱组和阳性对照组中明显降低（P＜0.05），而在阴性对照组中无明显变化（P＞0.05）。此外，岩黄连总碱组中巨噬细胞的焦亡率较阳性对照组无明显变化（P＞0.05），而较阴性对照组显著降低（P＜0.05）。②与焦亡模型组相比，细胞焦亡相关因子NLRP3、caspase-1、GSDMDmRNA和蛋白的表达量在岩黄连总碱组和阳性对照组中明显降低（P＜0.05），而在阴性对照组中无明显变化（P＞0.05）。此外，岩黄连总碱组中细胞焦亡相关因子的mRNA和蛋白较阳性对照组无明显变化（P＞0.05），而较阴性对照组显著降低（P＜0.05）。③与焦亡模型组相比，炎症因子IL-1β和IL-18在焦亡模型组中的表达量较阴性对照组无明显变化（P＞0.05），而在岩黄连总碱组和阳性对照组中明显降低（P＜0.05）。此外，岩黄连总碱组中IL-1β和IL-18的表达量较阳性对照组无明显变化（P＞0.05），而较阴性对照组显著降低（P＜0.05）。 结论：1.THP-1细胞在50ng/mL的PMA诱导下，可以成功被诱导为巨噬细胞。 2.1μg/mLPg-LPS诱导巨噬细胞24h后，可以导致巨噬细胞发生焦亡，成功建立巨噬细胞焦亡模型。 3.岩黄连总碱对巨噬细胞的焦亡可以产生明显的抑制作用，其呈现出与NLRP3/Caspase-1炎症小体的抑制剂类似的细胞焦亡抑制效应。
岩黄连总碱;巨噬细胞;牙龈卟啉单胞菌脂多糖;三磷酸腺苷;细胞焦亡
广西医科大学
硕士
口腔临床医学
陶人川
2021
中文
R361.3
2022-04-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）