MicroRNA-505靶向CRTC1调控犬骨髓间充质干细胞成骨分化的初步研究
目的：探究牵张成骨与骨折早期过程中有明显表达差异的miRNA和其预测的靶基因，对犬BMSCs的成骨分化是否有调控作用，为阐明牵张成骨能够快速成骨的机制提供理论依据。 方法： 1.犬BMSCs体外分离培养、鉴定： 在严格的无菌操作下，从幼犬胫骨骨髓中抽取骨髓血液，通过密度梯度离心法获得骨髓间充质干细胞。鉴定方法：①显微镜下观察BMSCs的形态学特点②流式细胞术检测BMSCs的表面标记抗原③茜素红染色检测细胞内钙结节的形成情况，检测该细胞的成骨向分化能力。 2.miRNA及靶基因的筛选： 2.1提取犬牵张组与犬骨折组愈合组织的miRNA，筛选课题组前期高通量测序结果中表达下调前10的miRNA，验证在组织中的相对表达量差异。体外培养BMSCs，分为正常组（N）和成骨诱导组（B），分别提取其1天、3天、5天、7天的miRNA，进一步筛选与成骨分化相关的miRNA，进行成骨分化机制研究。 2.2结合生物信息学分析和文献复习，预测出miR-505参与成骨相关的靶基因。使用慢病毒转染分别过表达或抑制该miRNA，分为4组：①过表达组、②过表达慢病毒空载体组、③抑制组、④抑制慢病毒空载体组。检测以上预测靶基因的表达是否受该miRNA影响。最后通过双荧光素酶报告基因检测实验加以验证。 3.miR-505靶向CRTC1对BMSCs成骨分化的影响： 使用慢病毒转染分别过表达或抑制该miRNA，分为4组：①过表达组（505+）、②过表达慢病毒空载体组（505+NC）、③抑制组（505-）、④抑制慢病毒空载体组（505-NC）。通过qRT-PCR、WB、茜素红染色检测各组中靶基因和成骨分化相关指标OCN的表达差异以及该miRNA对犬BMSCs成骨分化能力的影响。通过CCK8、Transwell实验检测该miRNA对BMSCs增殖、迁移能力的影响。 结果： 1.BMSCs体外分离培养、鉴定结果： 1.1密度梯度离心法分离培养出的犬BMSCs的原代细胞，24小时后首次换液，其种瓶48小时后可见贴壁，呈短梭形，可见少数细胞集落，5-7天左右，集落扩大、融合，细胞密度达80%-90%时即可传代。镜下见细胞的形态呈梭形，贴壁生长，密集处可呈鱼群状排列。 1.2流式细胞仪检测细胞表面标志物CD90、CD44的阳性率分别为97.9%与98.0%,而CD45、CD34的阳性率分别为0.39%与2.11%。以上结果表明，该骨髓间充质干细胞纯度较好。 1.3成骨诱导培养基培养21天后，骨髓间充质干细胞能够向成骨方向分化，茜素红染色可见橘红色钙结节。 2miRNA及靶基因的筛选结果： 2.1课题组前期高通量测序结果中表达下调前10的miRNA中，miR-505和miR-551b的表达差异最显著。 2.2将BMSCs分为正常组（N）和成骨诱导组（B），分别培养1天、3天、5天、7天，miR-505的表达差异最显著。 2.3使用生物信息学方法并结合文献，预测CRTC1、E2F2、WNT10B是miRNA-505可能的成骨相关靶基因。 2.4使用慢病毒转染分别过表达或抑制miR-505，分为4组：①过表达组（505+）、②过表达慢病毒空载体组（505+NC）、③抑制组（505-）、④抑制慢病毒空载体组（505-NC）。qRT-PCR结果显示，过表达miR-505使CRTC1表达量下降，抑制miR-505使CRTC1表达量上升，具有统计学差异。E2F2、WNT10B的表达统计学差异不显著或者与miR-505无明显相关性。双荧光素酶报告基因检测实验显示miR-505能够靶向作用于CRTC1。 3miR-505靶向CRTC1对BMSCs成骨分化影响的结果： 3.1使用慢病毒转染分别过表达或抑制miR-505，分为4组：①过表达组（505+）、②过表达慢病毒空载体组（505+NC）、③抑制组（505-）、④抑制慢病毒空载体组（505-NC）。qRT-PCR结果显示，过表达miRNA-505后成骨分化相关基因OCN表达量下降，抑制miRNA-505后成骨分化相关基因OCN表达量上升(p＜0.05)。WB结果显示，过表达miR-505时，CRTC1、OCN蛋白表达量下降；反之抑制miR-505时，CRTC1、OCN蛋白表达量上升。茜素红结果显示，抑制miR-505时钙结节数量较多、分布较广泛。综上所述，抑制miR-505表达后，BMSCs成骨分化能力有明显提高。 3.2CCK8和Transwell结果显示，miR-505对犬BMSCs的增殖、迁移能力无显著影响。 结论： 1犬下颌骨牵张早期较骨折早期高通量测序结果中下调前10的miRNA中，miR-505在组织层面和细胞层面均证明与成骨分化有显著关联。同时预测CRTC1为miR-505成骨相关的靶基因。 2miR-505可以在基因和蛋白水平负调控CRTC1的表达，同时抑制miR-505可提高犬BMSCs成骨分化能力，miR-505可能通过靶向CRTC1影响犬BMSCs的成骨分化。 3miR-505对犬BMSCs的增殖、迁移能力无显著影响。
骨髓间充质干细胞;microRNA-505;CRTC1;成骨分化
广西医科大学
硕士
口腔临床医学
周诺
2021
中文
R329.2
2022-04-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）