miR-23a-3p通过靶向作用于LRP5调控人牙周膜干细胞成骨分化的实验研究
目的： 本实验通过慢病毒介导抑制/过表达miR-23a-3p、沉默LRP5来探讨miR-23a-3p在人牙周膜干细胞（HPDLSCs）成骨分化过程中的作用机制，预测miR-23a-3p的分子靶标，并深入研究miR-23a-3p、LRP5与HPDLSCs在成骨分化过程中的相互关系，为探索正畸牙周骨改建的机制提供一定的理论依据与新思路。 方法： 1.收集临床上12-20岁因正畸拔除的前磨牙，采用组织块培养法获取原代细胞，并通过有限稀释法分离纯化HPDLSCs，为后续实验提供细胞。进而通过细胞形态学观察、CCK8法检测细胞增殖能力、细胞集落克隆形成率（CFU-F）检测、流式细胞仪鉴定细胞表面分子标志物、免疫荧光化学染色法及成骨成脂诱导分化实验等方法鉴定细胞。 2．取生长状态良好的2-3代HPDLSCs接种于六孔板并诱导其成骨分化。在诱导0d、3d、5d、7d、14d、21d后通过RT-qPCR、WB检测LRP5mRNA和LRP5蛋白表达的变化量。 3．构建过表达与抑制miR-23a-3p、shRNA-LRP5慢病毒载体，设置不同组的MOI=20、50、80、100转染HPDLSCs，选出转染HPDLSCs的最佳MOI；以测出最佳的MOI病毒转染HPDLSCs，通过CCK8法检测miR-23a-3p、shRNA-LRP5慢病毒载体对HPDLSCs增殖能力的影响。 4．miR-23a-3p、shRNA-LRP5慢病毒转染HPDLSCs，经嘌呤霉素筛选后，通过RT-qPCR检测LRP5、miR-23a-3p基因的表达，以明确miR-23a-3p、shRNA-LRP5慢病毒转染HPDLSCs后miR-23a-3p的抑制及过表达效果、沉默LRP5的效率，筛选出沉默LRP5基因的最佳靶点。 5．慢病毒转染HPDLSCs成功后诱导HPDLSCs成骨分化，诱导成骨7d后检测各组miR-23a-3p的变化，并通过RT-qPCR检测LRP5、ALP、RUNX2基因的表达情况、WB检测LRP5、ALP、RUNX2蛋白的表达情况。实验分组：Blank组（空白对照组）、miR-23a组（miR-23a-3p mimics group）、miR-23aNC组（miR-23a-3p mimics negative control group）、miR-23aI组（miR-23a-3p inhibitor group）、miR-23aNCI组（miR-23a-3p inhibitor negative control group）。 6．shRNA-LRP5慢病毒转染HPDLSCs后诱导HPDLSCs成骨分化，诱导成骨7d后通过RT-qPCR检测ALP、RUNX2基因的表达情况、WB检测ALP、RUNX2蛋白的表达情况。实验分组：shNC组（阴性对照组）、shLRP5组（shRNA-LRP5group）。 7．通过shRNA-LRP5慢病毒介导沉默LRP5基因后转染miR-23a-3p慢病毒，成功抑制miR-23a-3p后诱导HPDLSCs成骨分化，7d后通过RT-qPCR检测LRP5、ALP、RUNX2基因的表达情况、WB检测LRP5、ALP、RUNX2蛋白的表达情况。实验分组：NC+shNC组（阴性对照组）、miR-23aI+shNC组（miR-23a-3p inhibitor+shRNA-LRP5negative control group）、miR-23aI+shLRP5组（miR-23a-3p inhibitor+shRNA-LRP5group）。 结果： 1、本实验所获取的HPDLSCs形态呈纺锤长梭形、以放射状排布从组织块向外生长，进行有限稀释纯化后获取稳定的HPDLSCs备后续实验使用；细胞增殖呈指数型增长；细胞克隆实验表明细胞有较高的克隆形成率15%；流式细胞检测及免疫荧光染色结果表明实验所获取的HPDLSCs来源于间充质；成骨诱导后可见矿化结节形成，成脂诱导可见“葡萄串样”分布的圆形脂滴形成。 2、与未诱导的0d组相比，HPDLSCs在成骨诱导过程中LRP5的基因及蛋白的表达量均逐渐上升，其中LRP5mRNA与蛋白的表达量在7d达到最大值，之后逐渐下降。与0d相比，3d、5d、7d、14d的LRP5mRNA表达差异显著（p＜0.01）。 3、慢病毒转染HPDLSCs72h后，可测出转染的最佳MOI=20，此时细胞生长状态良好，于荧光显微镜下可见红、绿荧光表达率达85%以上，经CCK8检测，慢病毒载体对HPDLSCs增殖能力无影响。 4、经RT-qPCR检测，与阴性对照组相比，miR-23a组病毒转染HPDLSCs上调miR-23a-3p高达475.24%，miR-23aI组病毒转染HPDLSCs下调miR-23a-3p达34.05%（p＜0.05）；与阴性对照组相比，shLRP5-1组病毒转染HPDLSCs沉默LRP5的效率为97.19%，shLRP5-2为84.14%，shLRP5-3为92.69%（p＜0.01），可得出shLRP5-1为沉默LRP5基因的最佳靶点。成功构建慢病毒介导的抑制/过表达miR-23a-3p的模型、沉默LRP5基因的模型。 5、与Blank组相比，miR-23aNC与miR-23aNCI组中miR-23a-3p的表达差异不明显（p＞0.05），miR-23a组中miR-23a-3p的表达明显增加（p＜0.01），miR-23aI组中miR-23a-3p的表达明显降低（p＜0.01）；与阴性对照组相比，miR-23a组中LRP5、ALP、RUNX2的蛋白表达均下降，miR-23aI组中LRP5、ALP、RUNX2的蛋白表达均增加；与对照组相比，miR-23a组中LRP5、ALP、RUNX2的mRNA表达均下降，miR-23aI组中LRP5、ALP、RUNX2的mRNA表达均增加，差异均有统计学意义（p＜0.01）。 6、与shNC组相比，shLRP5组的ALP、RUNX2的mRNA、蛋白表达水平均下降（p＜0.01）。 7、与NC+shNC组相比，miR-23aI+shNC组ALP、RUNX2的mRNA、蛋白表达均增加，除RUNX2的蛋白差异不明显外，其余差异显著（p＜0.05）；与miR-23aI+shNC组相比，miR-23aI+shLRP5组ALP、RUNX2的mRNA、蛋白表达均下降（p＜0.05）。 结论： 1、本实验成功分离培养并提纯HPDLSCs，在诱导HPDLSCs21d成骨分化中验证了LRP5与HPDLSCs成骨分化具有相关性。 2、本实验成功构建慢病毒介导的抑制/过表达miR-23a-3p基因模型，从基因与蛋白水平再次验证了miR-23a-3p可能在HPDLSCs成骨分化过程中起负向调控作用。 3、本实验成功构建慢病毒介导的“抑制miR-23a-3p/沉默LRP5”基因模型，从基因与蛋白水平验证miR-23a-3p可能通过靶向于LRP5负向调控HPDLSCs的成骨分化。
口腔正畸;人牙周膜干细胞;非编码RNA-23a-3p;低密度脂蛋白受体相关蛋白5;成骨细胞;细胞分化
广西医科大学
硕士
口腔临床医学
康娜
2021
中文
R783.5
2022-04-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）