ERCC4基因调控网络在结直肠癌免疫调控中的作用机制研究
本文主要从以下几部分进行论述： 第一部分 基于生物信息学分析结直肠癌患者中特征基因型突变与潜在免疫浸润的探索 目的：免疫细胞浸润在免疫稳态中起着至关重要的作用。各种免疫细胞浸润可以通过复杂的肿瘤-免疫互作机制来调节肿瘤进展。了解肿瘤免疫浸润状态并发现新的免疫相关预后生物标志物是目前亟待解决的问题。 材料和方法：我们利用下一代测序（Next-generationsequencing,NGS）技术检测了与肿瘤特征相关的基因谱，并收集了相应患者的临床参数资料。运用生物信息学技术对该基因谱内的基因进行富集分析与相关性分析。然后我们通过TIMER2.0分析差异基因在CRC肿瘤组织和癌旁正常结肠组织中的表达差异、预后、免疫浸润和免疫细胞标记物的相关性。最后我们使用UALCAN数据库分析差异基因的启动子甲基化水平。 结果：突变基因被富集到增殖基因驱动型、代谢基因驱动型和微环境基因驱动型三类。三类基因标准化前后比较表明，微环境驱动基因在CRC中所占的权重更大。分析突变基因和临床信息，以获得与免疫相关的差异基因（ESR2、KDR、NRAS、ERCC4、CYP2C19、MSH2和ROS1（P＜0.05、P＜0.05、P＜0.05、P＜0.05、P＜0.05、P＜0.05和、P＜0.05））。使用TIMER2.0数据库分析后发现ERCC4在结肠腺癌（Colonadenocarcinoma,COAD）中的表达较高，且与预后呈正相关(P＜0.01)。随后我们分析了ERCC4与免疫浸润之间的关系，结果显示ERCC4与B细胞(R=0.342,P＜0.001)、CD8+T细胞(R=0.336,P＜0.001)、CD4+T细胞(R=0.444,P＜0.001)、巨噬细胞(R=0.503,P＜0.001)、嗜中性粒细胞(R=0.46,P＜0.001)和树突状细胞(R=0.458,P＜0.001)的免疫浸润程度呈正相关。进一步探究ERCC4与免疫细胞的联系，免疫细胞标志物分析表明，ERCC4在COAD中与B细胞、CD8+T细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞、Th1细胞、Treg和单核细胞的细胞表面标记物显着正相关。最后利用UALCAN数据库在COAD中分析ERCC4启动子甲基化水平，结果显示肿瘤组织中的ERCC4的启动子甲基化水平相对于癌旁正常组织显着增加。不仅如此，老年人和超重人群的ERCC4启动子甲基化水平高于对照组(P＜0.05)。男性的ERCC4启动子甲基化水平高于女性(P＜0.05)。 结论：ERCC4mRNA表达可能是COAD中参与免疫微环境及其增强免疫浸润的重要因素。Kaplan-Meier生存分析结果表明，ERCC4基因对COAD的OS具有预后价值，单独的ERCC4基因可以作为COAD的预后分子生物学标志物。 第二部分 探究结肠腺癌细胞内不同ERCC4表达水平对MHC-Ⅰ类分子的影响 目的：本研究是对于过表达和沉默状态下的ERCC4在结肠腺癌细胞中对免疫细胞可能产生的影响以及作为免疫治疗增敏剂的价值分析。 材料和方法：首先我们对人结肠腺癌细胞系（DLD-1）进行了沉默和过表达病毒载体的转染，并使用RT-qPCR及Westernblot技术检测ERCC4基因的表达水平。随后我们再次利用RT-qPCR及Westernblot技术检测了转染后DLD-1细胞上作为CD4+T细胞、CD8+T细胞适应性配体之一的MHC-Ⅰ类分子表达水平。 结果：首先使用包含过表达和沉默的慢病毒载体对结肠癌细胞DLD-1进行转染，最终构建成H-DLD-1、NC1-DLD-1；L-DLD-1、NC2-DLD-1两组四种结肠癌细胞株。RT-qPCR结果显示ERCC4在mRNA水平NC2-DLD-1细胞中的表达量显著性高于L-DLD-1细胞（P＜0.05），NC1-DLD-1细胞中的表达量显著性低于H-DLD-1细胞（P＜0.01）。Westernblot结果显示ERCC4在蛋白水平的过表达（P＜0.01）和沉默P＜0.05）同样成功。然后通过RT-qPCR及Westernblot检测不同细胞系的HLA-A、HLA-B和HLA-C的mRNA和蛋白表达水平。结果表明NC1-DLD-1中HLA-A和HLA-C的mRNA水平较H-DLD-1增加了2.44倍（P＜0.05）和1.54倍（P＜0.05）。H-DLD-1细胞中的HLA-A、HLA-B和HLA-CmRNA水平较L-DLD-1细胞中显著提升（P＜0.05、P＜0.05和P＜0.01）。H-DLD-1中HLA-A的蛋白表达量较NC1-DLD-1升高了1.68倍（P＜0.01）。与NC2-DLD-1细胞相比，L-DLD-1中HLA-C的蛋白表达量降低为48.63%（P＜0.01）。另外，L-DLD-1中HLA-A、HLA-B和HLA-C的蛋白表达量较H-DLD-1分别降低为26.89%（P＜0.01）、31.66%（P＜0.01）和37.23%（P＜0.05）。 结论：在细胞实验验证中发现，HLA-A、HLA-B和HLA-C与ERCC4表达量变化正相关。该结果暗示ERCC4可以通过增强MHC-Ⅰ类分子的识别来增加免疫细胞的浸润。MHC-Ⅰ类分子与CD4+T细胞、CD8+T细胞结合有助于加强免疫系统对肿瘤抗原的识别和呈递能力。ERCC4可能是COAD的一个独立免疫治疗增敏靶点，并且ERCC4对于结肠腺癌有一定的预后价值，但是未来仍需要进一步的研究证实。
结直肠癌;ERCC4基因;基因表达;免疫调控
广西医科大学
硕士
外科学
唐卫中
2021
中文
R735.34
2022-04-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）