甲状腺相关眼病CD34+与CD34-眼眶成纤维细胞的生物学差异研究
目的：分选出甲状腺相关眼病（Thyroid-associatedophthalmopathy，TAO）CD34+、CD34-眼眶成纤维细胞（Orbitalfibroblast,OF），建立相应的体外培养模型，通过分子生物学技术，检测它们之间的生物学差异。以进一步明确TAO的发病机制，为TAO的早期诊断和治疗开辟新的思路。 方法：本实验分为三个部分：第一部分，正常与TAO眼眶成纤维细胞(Gravesophthalmopathyorbitalfibroblast,GO-OF)的提取、鉴定与培养，建立正常OF与GO-OF体外单独培养模型；第二部分，CD34+OF、CD34-OF的分选提纯和CD34+OF、CD34-OF体外单独培养模型的建立；第三部分，用分子生物学方法检测正常OF、GO-OF、CD34+OF、CD34-OF的生物学指标，数据统计分析对比后讨论。本实验中的TAO组，细胞选取来自经EUGOGO系统临床分级标准评估为视力威胁型的甲状腺相关眼病患者（n=4），从眼眶减压手术获得的眼眶脂肪结缔组织中，提取、培养人眼眶成纤维细胞（本操作已获得广西医科大学第一附属医院伦理委员会批准，术前患者已签署知情同意书）。对照组（Negativecontrol，NC组）细胞选取为与实验组其他条件（如年龄、性别、BMI、既往病史）相近，为因陈旧性义眼座植入或因眼外伤、眼球萎缩需行眼球摘除的患者（n=4），从手术获得的眼眶脂肪结缔组织中，提取、培养人眼眶成纤维细胞（本操作已获得广西医科大学第一附属医院伦理委员会批准，术前患者已签署知情同意书）。实验中，将球后眼眶结缔组织标本进行初步杂质（如微小血管等）剔除，经组织破碎、胰酶消化、离心等操作后，移入T25细胞培养瓶，用倒置显微镜观测细胞贴壁情况及生长状态。当细胞经过传代纯化，生长稳定后，用免疫组织化学染色法鉴定细胞的来源和种属，并观察细胞形态，确定所提取的原代细胞为眼眶组织来源的成纤维细胞。下一步，采用免疫磁珠分选的方法将GO-OF分选为CD34+OF和CD34-OF两组，然后分别进行体外培养，待细胞生长稳定后，分别进行流式细胞仪纯度检测。当该组细胞纯度达到实验条件后，继续进行体外培养。至此，CD34+OF、CD34-OF体外培养模型建立完成。将不同细胞系分为4组：NC组、GO-OF组、CD34+OF组、CD34-OF组。将各组细胞以1∶2或1∶3进行传代，经胰酶消化计数后，种入96孔板在完全培养基中（10%FBS）培养，用CellCountingKit-8（CCK-8）法，经多功能荧光分析仪获取各组细胞在24h、48h、72h、96h、120h的光密度值（Opticaldensity,OD值），并记录各组细胞的生长情况。接下来，分别提取各组细胞的RNA进行逆转录，用RT-qPCR检测NC组、GO-OF组、CD34+OF组、CD34-OF组的炎症因子白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）、干扰素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）在mRNA水平的相对表达情况。与此同时，我们将消化计数后的等量的细胞转入T25培养瓶中进行低血清（含3%胎牛血清）培养，培养24h后，分别提取上清进行酶联免疫吸附剂测定法（Elisa）检测IL-6与IFN-γ在蛋白水平的表达情况。 结果：我们把非TAO患者和TAO患者术中提取的眼眶成纤维组织经过分离提纯后进行了细胞的原代培养，培养过程中对细胞的形态、生长趋势和生长规律进行了仔细观察，从形态学判断其为眼眶成纤维细胞。接下来对这两组细胞进行免疫组织化学染色鉴定，结果显示myoglobin、desmin、keratin17、S100B、keratin17抗体表达阴性，只有vimentin抗体表达阳性。由此鉴定结果提示这两组细胞均为眼眶成纤维细胞，同时排除了其他细胞种属的可能性。我们把来源于TAO患者的眼眶成纤维细胞进行免疫磁珠分选，在对细胞进行CD34免疫磁珠孵育后，在强磁场的作用下，将GO-OF分为CD34+组和CD34-组，在对这两组细胞进行CD34+抗体孵育后上流式细胞仪检测，经反复实验，CD34+组纯度均＞97.0%，CD34-组纯度均＞87.0%，两组纯度均满足一般实验对CD34研究的需要。为了探究NC、GO-OF、CD34+OF、CD34-OF、GO-OF之间的生长差异，我们分别对这4组细胞进行了CCK-8测定，通过对这4组细胞5天生长情况的观察和检测，我们发现，4组细胞的OD值均呈上升趋势，但上升趋势之间存在着一定的差异。通过对比第5天得到的4组OD值结果，我们发现CD34+OF组细胞的增殖速度高于GO-OF组，CD34-OF组细胞的增殖速度低于GO-OF组，差异有统计学意义；NC组细胞与CD34-OF组相关表现差异无统计学意义。为了明确NC、GO-OF、CD34+OF、CD34-OF之间部分炎症因子表达的差异，我们通过RT-qPCR和Elisa分别对这4组细胞的炎症因子IL-6和IFN-γ进行了测定，结果显示CD34+OF的IL-6和IFN-γ在mRNA和蛋白水平的表达量均为4组最高，CD34-OF的IL-6和IFN-γ在mRNA和蛋白水平的表达量均为4组最低，GO-OF位于CD34+OF与CD34-OF之间，差异均有统计学意义；NC与CD34-OF表达差异不明显，差异无统计学意义。 结论：通过对手术标本组织的提取、原代培养的方式，建立正常和TAO的OF的体外原代细胞培养模型，是目前对TAO的研究基础。采用磁珠分选的方法可成功将GO-OF分选为CD34+OF和CD34-OF，细胞存活率较高，生长状态良好，且CD34+的分选效率要高于CD34-的分选效率。TAO的OF相比正常OF，可表现出更强的增殖能力，相关促炎因子表达也更多；其中，TAO眼眶中的CD34+OF的增殖和炎症因子分泌能力强于总的OF，CD34-OF的增殖和炎症因子分泌能力弱于总的OF，患者的CD34-OF与正常OF相关指标无明显差异。CD34+OF可能是TAO眼眶中发生炎症与增殖反应的主要眼眶成纤维细胞，通过对外周血液中CD34+纤维细胞的检测，或许能达到早期诊断TAO的目的；阻止CD34+纤维细胞对眼眶组织的浸润或抑制眼眶组织中CD34+OF的活性，有可能成为抑制或延缓TAO发生与发展的作用的新手段。
甲状腺相关眼病;CD34;眼眶成纤维细胞;差异分析;发病机制
广西医科大学
硕士
眼科学
李凯军
2021
中文
R777.5
2022-04-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）