应用网络药理学探讨三七总皂苷治疗糖尿病视网膜病变的机制及实验验证
目的：三七总皂苷（PanaxNotoginsengSaponins，PNS）应用于治疗糖尿病视网膜病变（DiabeticRetinopathy，DR）的具体作用机制目前尚不清楚，本研究采用网络药理学与分子对接技术相结合的方法对其作用机制进行探讨，并通过CCK-8细胞增殖实验（CellCountingKit-8，CCK-8）、蛋白质免疫印迹实验（WesternBlot，WB）等实验进行细胞水平的验证。 方法： 1.运用网络药理学探讨三七总皂苷对于治疗糖尿病视网膜病变的机制。 （1）运用TCMSP数据获取三七总皂苷的五个有效化合物的ADME参数；并从PubChem数据库下载这些化合物的2D化学结构。（2）采取反向药效团匹配法，用PharmMapper数据库预测三七总皂苷的基因靶点。（3）应用5个疾病相关数据库来预测糖尿病视网膜病变的基因靶点。（4）用UniProt软件对所有基因名称进行标准化。（5）将三七总皂苷和糖尿病视网膜病变的基因靶点整合在一起，获得共同靶点。（6）利用R语言对三七总皂苷和糖尿病视网膜病变的共同靶基因进行功能和通路富集分析。（7）用STRING数据库探索蛋白质-蛋白质间相互作用(Protein-ProteinInteraction，PPI)网络，并通过网络拓扑学参数筛选出网络中的核心靶点。（8）将三七总皂苷有效化合物、三七总皂苷和糖尿病视网膜病变的共同靶点以及相关信号通路整合至一张网络，构建出三七总皂苷治疗糖尿病视网膜病变的药物化合物-靶点-通路网络。（9）用Cytoscape_v3.7.2软件将网络进行可视化。 2.应用分子对接实验验证网络药理学的研究结果。 （1）随机选择两个具有良好药代动力学特性的三七总皂苷化合物和两个核心基因对应的关键蛋白。（2）将化合物的二维化学结构进行能量最小化处理和三维化学结构转换处理。（3）下载这两个蛋白质三维结构后，做移除小分子配体和水分子、加氢、杂原子基团的删除、缺失侧链的添加和蛋白质的优化等处理。（4）用SchrodingerMaestrov10.2软件以Glide的方法完成分子对接实验验证。 3.用CCK-8实验检测不同浓度葡萄糖、甘露醇和三七总皂苷干预后人视网膜色素上皮细胞ARPE-19的细胞活力，来探究视网膜色素上皮细胞是否会受到不同浓度葡萄糖、甘露醇和三七总皂苷的影响；并检测不同浓度三七总皂苷干预高糖（30mmol/L）处理后的人视网膜色素上皮细胞ARPE-19随时间推移的细胞活力变化，确定三七总皂苷作用于高糖处理的人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19的最适有效浓度。 4.用Westernblot实验验证基因富集数目最多的信号通路。检测常规培养基培养、添加三七总皂苷培养、添加高糖培养以及添加高糖和三七总皂苷培养的ARPE-19细胞中通路相关蛋白的表达水平。 结果： 1．分别获得了三七总皂苷和糖尿病视网膜病变相关的279个和1007个靶点基因，并获得了67个共同的靶点基因。 2．对共同靶点基因基因进行GO和KEGG功能和通路富集，并用气泡图显示了每类GO的前10项条目和KEGG的前30条通路。 3．其中，PI3K/Akt信号通路是基因富集数目最多的通路。 4．以p＜0.01和富集基因数＞10为标准，筛选出13条信号通路；将三七总皂苷5个有效化合物、67个共同的靶点基因和筛选出13条信号通路整合，构建了三七总皂苷治疗糖尿病视网膜病变的药物化合物-靶点-通路网络，发现有30个基因在这些信号通路中富集。 5．构建了这30个基因的PPI网络，并筛选出了13个核心基因靶点。 6．分子对接实验验证表明，化合物和受体蛋白之间的对接分数分别为：HRAS与人参皂苷Rg1：5.574；HRAS与人参皂苷Rd：6.863；MAPK1与人参皂苷Rg1：5.144；MAPK1与人参皂苷Rd：5.738。化合物和靶标之间结合活性较好，说明我们构建的化合物-靶点-通路网络的可靠性较高。 7．CCK-8实验中，15、30、60mmol/L葡萄糖溶液干预ARPE-19细胞，12h后30、60mmol/L组细胞活力均受到抑制，且成剂量依赖性（P＜0.05，）;而单独用不同浓度的甘露醇（15、30、60mmol/L）或三七总皂苷（200、400、600mmol/L）干预细胞，12h后各组间细胞活力无显著差异，说明ARPE-19细胞活力不受渗透压和三七总皂苷浓度的影响。高糖（30mmol/L）干预后加不同浓度三七总皂苷（200、400、600mmol/L）与只用高糖干预相比，ARPE-19细胞活力均有显著提升，且在三七总皂苷浓度为400mmol/L时，提升较高，故确定400mmol/L为三七总皂苷干预高糖处理的人视网膜色素上皮细胞ARPE-19细胞的最适有效浓度。 8．Westernblot实验结果表明，30mmol/L葡萄糖培养基培养ARPE-19细胞可使p-Akt蛋白的表达显著升高，而加入400mmol/L三七总皂苷干预后，可使p-Akt蛋白表达下降。单独用400mmol/L三七总皂苷干预正常培养基培养的ARPE-19细胞p-Akt蛋白表达也有所下降，说明用三七总皂苷能降低高糖处理的ARPE-19细胞中p-Akt的表达，即抑制PI3K/Akt信号通路的磷酸化和激活，从而在治疗糖尿病视网膜病变的过程中发挥作用。 结论： 1．通过本研究，我们构建了三七总皂苷治疗糖尿病视网膜病变过程中的药物化合物-靶点-通路网络，初步阐明了三七总皂苷治疗糖尿病视网膜病变的基本药理机制，为进一步的实验研究工作奠定了基础。 2．三七总皂苷能够通过抑制PI3K/Akt通路的激活，在糖尿病视网膜病变的治疗中发挥有效作用。
糖尿病视网膜病变;三七总皂苷;网络药理学;分子对接;视网膜色素上皮细胞
广西医科大学
硕士
眼科学
黄敏丽
2021
中文
R774.1
2022-04-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）