甘草查尔酮B对RANKL诱导的破骨细胞功能和对雌激素缺乏诱导的骨质疏松症作用机制研究
在老龄化人群中，尤其是绝经后妇女，骨量和骨微结构迅速减少，导致骨质疏松症和其他溶骨性疾病的发生。骨质疏松的本质是骨微结构的破坏，这是成骨细胞主导的骨形成和破骨细胞主导的骨吸收（主要是骨吸收）之间失衡的结果。因此，对破骨细胞形成和功能研究与开发新的治疗靶点和药物成为治疗此类溶骨性疾病的重点。现阶段治疗骨质疏松症的药物如双磷酸盐、迪诺塞布单抗等药物虽然有明显的治疗效果但其副作用也同样不可忽视。甘草查尔酮B（LicochalconeB，LCB）是从甘草中提取的黄酮类化合物，已被证实具有多种生物学效应，但在骨代谢中鲜有提及。在前期研究中心，我们发现LCB对破骨细胞的生成具有明显的抑制作用，且破骨细胞数量与LCB剂量呈负相关。本研究将进一步探究其深层机制并观察LCB在对抗雌激素缺乏诱导的小鼠骨丢失方面的效果。 目的：探究LCB在体外对破骨细胞形成和破骨细胞骨吸收功能的干预机制，并观察LCB在体内对对抗雌激素缺乏诱导的小鼠骨丢失方面的效果。 方法：1.提取C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞（BMMSCs）经巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导成为骨髓单核巨噬细胞（BMMs）再经核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导与不同剂量LCB干预后，以CCK-8法观察LCB对细胞的活性影响，以分化实验观察其对破骨细胞形成的影响，以骨吸收实验观察其对破骨细胞骨吸收功能的影响。2.运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术测定LCB对破骨细胞特异性基因表达的影响。运用WesternBlot技术验证药物对破骨细胞形成与功能信号通路的影响。3.基于体外细胞实验，构建小鼠雌激素减退模型（OVX模型）并运用免疫组化和Micro-CT分析评估药物在体内对破骨细胞的抑制效果和对雌激素减退导致的骨质疏松的治疗效果。通过肝、肾、小肠的病理组织切片Hamp;E染色分析LCB在小鼠体内的代谢毒性作。小鼠被随机分为4组，每组6只，分别为假手术组（sham组）、安慰剂组（OVX/Vehicle组）、低剂量组（L组）和高剂量组（H组）。 结果：1.分化实验表明不同浓度的LCB（2.5、5、7.5、10μM）对破骨细胞的分化形成具有明显抑制作用，且破骨细胞数量与LCB浓度呈现出负相关（P＜0.001），CCK-8实验表明实验剂量的LCB对BMMs细胞正常增殖活性无影响。伪足小体肌动蛋白环（PodsomeBelt/F-actinRing）染色实验表明不同浓度的LCB对破骨细胞核融合及肌动蛋白环形成面积具有明显的抑制作用（P＜0.05）。骨吸收实验表明LCB的干预有效地抑制了破骨细胞对骨片的侵蚀、溶解功能（P＜0.001）。氧化应激活性氧生成实验（ROS）表明LCB对抑制破骨细胞形成及发挥功能过程中的氧化应激反应具有明显的抑制作用，荧光通量数据差异具有统计学意义（P＜0.05）。2.实时荧光定量PCR实验表明LCB能有效抑制破骨细胞形成过程中CTSK、DC-Stamp、C-fos、TRAcP、NFATc1和MMP-9等相关基因的特异性表达，差异具有统计学意义（P＜0.001）。同时LCB也对氧化应激反应相关自由基清除因子具有促进作用（P＜0.05）。WesternBlot实验表明LCB对破骨细胞活化过程中MAPK信号通路上的JNK、ERK的磷酸化具有抑制作用，对NFκB通路中的IκB泛素化降解和P65磷酸化激活具有明显的抑制作用（P＜0.05）。同时LCB对ROS通路中的HO-1、Catalase和GSR具有显著的激活作用（P＜0.05）。3.在小鼠OVX模型体内实验中，Micro-CT分析表明LCB能够降低由雌激素减退造成的小鼠股骨骨量丢失（P＜0.05），即增加了手术后小鼠的骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁连接密度（Conn.Dn）及骨小梁厚度（Tb.Th）。同时小鼠股骨组织切片Hamp;E染色也得出同样的结论，小鼠股骨TRAcP染色显示相较于安慰剂组，LCB治疗后的小鼠破骨细胞显著减少（P＜0.05）。小鼠肝脏、肾脏及小肠的病理切片未提示组织异常。 结论：1.LCB对破骨细胞生成及骨吸收功能具有明显的抑制作用，且呈现负相关趋势。实验浓度的LCB对破骨细胞前体增殖活性无影响。LCB抑制了破骨细胞的podsomebelt/F-actin的形成从而抑制了破骨细胞对牛骨片的溶解吸收功能。2.LCB对破骨细胞分化与功能的影响是通过抑制破骨细胞形成相关基因并促进氧化应激反应相关自由基清除因子HO-1、Catalase和GSR的表达从而抑制了MAPK通路中ERK、JNK的表达与NFκB通路中IκB的泛素化降解。3.LCB对雌激素缺乏诱导的小鼠骨质疏松具有治疗作用，且未发现代谢毒性。
甘草查尔酮B;破骨细胞;骨吸收功能;骨丢失;实验药理
广西医科大学
硕士
外科学
赵劲民
2021
中文
R285.5
2022-04-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）