人肝癌相关成纤维细胞的原代培养及其分泌蛋白聚糖谱研究
目的：肝细胞癌（HCC）是癌症导致死亡的第四大原因，肝癌相关成纤维细胞在肝癌的进程中发挥着不可或缺的作用。糖基化作为蛋白质翻译后修饰的一种常见类型，已得到广泛研究。本研究通过原代培养的方式获取成纤维细胞，使用凝集素芯片获取肝癌相关成纤维细胞的分泌蛋白聚糖谱，为进一步探讨糖基化在肝癌发生发展中的作用提供实验基础。 方法：收集5对肝癌及其癌旁组织，对每份组织都分别采用组织块贴壁法和酶消化法联合组织块贴壁法进行原代培养，对比两种方法对组织周围爬出细胞天数的影响；通过反复贴壁法配合差速消化法对培养的原代混杂细胞进行纯化；通过RT-qPCR、WesternBlot、间接免疫荧光（IF）结合形态学观察的方法，鉴定培养的原代细胞是否为纯化的成纤维细胞；使用凝集素芯片检测分泌蛋白聚糖，获取肝癌相关成纤维细胞分泌蛋白聚糖谱。 结果： 1.使用组织块贴壁法的肝癌组织与使用酶消化法联合组织块贴壁法的肝癌组织相比，肝癌相关成纤维细胞的爬出天数分别为7.80±1.92天和5.80±1.78天，差异具有统计学意义（P=0.005）；使用组织块贴壁法的癌旁组织与使用酶消化法联合组织块贴壁法的癌旁组织相比，正常成纤维细胞的爬出天数分别为14.00±2.74天和6.40±1.14天，差异具有统计学意义（P=0.003）。 2.经纯化后的肝癌相关成纤维细胞胞体较大，呈长梭形或多边形，胞体突起较多；而正常成纤维细胞胞体小，呈长梭形或半月形，胞体突起较少，两种细胞在细胞密度较大时，均呈现“鱼群状”样生长；在两种成纤维细胞中均有FSP、FAP、α-SMA、Vimentin的表达，但在肝癌相关成纤维细胞中表达量更高。 3.肝癌相关成纤维细胞的分泌蛋白对CALSEPA、JAC、MPL、SSA、STL五种凝集素的亲和作用增强，而对IRA、IAA、PSA、CSA、GSL-IA4的亲和作用减弱。 结论： 1.通过建立改良的方法，酶消化法联合组织块贴壁法可加速细胞爬出，更适于原代培养成纤维细胞，可缩短实验进程。 2.通过对比hCAFs和NFs的分泌蛋白，分泌蛋白聚糖谱有所改变，提示肝癌相关成纤维细胞的分泌蛋白中T/Tn抗原、唾液酸、N-乙酰氨基葡萄糖结构增加；而N-乙酰半乳糖胺和α-甘露糖的结构减少。
肝细胞癌;成纤维细胞;肿瘤微环境;凝集素芯片;分泌蛋白聚糖谱
广西医科大学
硕士
临床检验诊断学
李山
2021
中文
R735.7
2022-04-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）