衰老标记蛋白30在高糖下ARPE-19和糖尿病小鼠视网膜中的表达
目的：从糖尿病与衰老之间生物学联系的角度探寻针对糖尿病视网膜病变（diabeticretinopathy,DR）早期病理改变的新标志物并进行初步验证，为开拓DR早期干预的新靶点提供理论依据。 方法：（1）通过生物信息学方法选择与糖尿病及衰老密切相关的目标蛋白：从在线数据库RatGenomeDatabase（RGD）分别搜索与人类糖尿病和衰老有关的基因，使用DAVID在线数据库进行重叠基因的富集功能分析（包括GO富集分析和KEGG富集分析），通过基因相互作用在线工具GeneMANIA和蛋白质相互作用数据库STRING了解其在基因和蛋白质水平上的相互作用，从中选出1个与糖尿病及衰老均密切相关的蛋白质进行下一步验证；（2）细胞模型中目标蛋白的验证：于不同浓度葡萄糖的DMEM培养基中培养人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19，正常对照组培养液的葡萄糖浓度为5.5mmol/L，实验组即高糖组培养液的葡萄糖浓度为25mmol/L；采用CCK-8检测法观察ARPE-19细胞于两组不同葡萄糖浓度培养条件下24h、48h、72h后的活力改变情况，并用实时荧光定量PCR（RealTimequantitativePCR,RT-qPCR）和蛋白免疫印迹法（westernblotting,WB）分别检测ARPE-19细胞于两组不同葡萄糖浓度培养条件下24h、48h、72h后细胞中衰老标记蛋白（senescencemarkerprotein30,SMP30）的mRNA及蛋白表达的情况；（3）动物模型中目标蛋白的验证：用高脂饲料联合链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）腹腔注射建立糖尿病小鼠模型，通过苏木精-伊红（HE）染色观察糖尿病小鼠视网膜组织的结构变化，并应用免疫组织化学法和RT-qPCR法分别检测SMP30的蛋白及mRNA在小鼠视网膜中的表达情况。 结果：（1）通过RGD共筛选出与人类糖尿病和衰老共相关的11个基因，富集分析显示其主要涉及神经元凋亡过程、凋亡过程负调控、一氧化氮生物合成过程的正调控、细胞衰老等，KEGG通路分析显示与线粒体生物发生和HIF-1信号通路相关，相互作用分析显示它们在基因和蛋白质水平上都有着相互作用关系，排除已被证实参与DR病理机制的因子，本研究选择相互作用网络中与之连接较为紧密的SMP30作为目标蛋白进行后续研究。（2）体外高糖培养24h的ARPE-19细胞活力与正常对照组组无统计学差异（P＞0.05）；而于高糖培养后48h和72h，高糖组ARPE-19细胞活力较正常对照组降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。高糖组ARPE-19细胞中SMP30mRNA的表达在各个时间点（24h、48h、72h）均较正常对照组降低（P＜0.01;P＜0.01;P＜0.001）。高糖组ARPE-19细胞中SMP30蛋白的表达在各个时间点（24h、48h、72h）亦均较正常对照组降低（P＜0.05;P＜0.05;P＜0.01）。（3）糖尿病小鼠视网膜各层排列不规则，其中内界膜不规则和神经节细胞排列错落紊乱尤为明显,RPE层连续性减弱。免疫组织化学法可见糖尿病组小鼠视网膜SMP30蛋白阳性着色强度明显较正常对照组弱。两组SMP30蛋白免疫阳性反应主要位于胞浆，分布于小鼠视网膜各层，其中神经纤维层、神经节细胞层、外丛状层SMP30蛋白免疫阳性着色强度较强。糖尿病组小鼠视网膜RPE层的SMP30蛋白阳性着色强度较正常对照组弱。RT-qPCR检测显示，糖尿病组小鼠视网膜中SMP30mRNA的表达较对照组显著降低（P＜0.05）。 结论：利用生物信息学筛选所得的与糖尿病和衰老共相关的SMP30在短期高葡萄糖培养的ARPE-19细胞和早期糖尿病小鼠视网膜组织中的表达均减低，值得进一步研究其作用机制以明确其可作为早期糖尿病所致视网膜损伤的敏感指标的可行性。
糖尿病视网膜病变;视网膜色素上皮细胞;衰老标记蛋白30;蛋白表达
广西医科大学
硕士
眼科学
梁皓
2020
中文
R774.13
2022-04-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）