基于CRISPR/Cas9技术敲除Endoglin基因抗肝癌的研究
背景：20世纪末，由约旦科学家Folkman首次提出肿瘤血管生成理论：若肿瘤不能生成血管，其体积只能生长到（1～2）立方毫米，且并不会发生任何转移；而新生血管生成以后则会发生质的改变，肿瘤体积成倍增长，生长速度也成倍增加，且更加容易发生转移。现在多数学者已经公认，肿瘤在生长及转移过程中的必要条件是需要有血管生成。肿瘤血管生成数量的多少主要是依靠微血管密度来衡量，一般我们选择使用CD31、CD34来标记肿瘤血管的表面分子。Endoglin（CD105）蛋白是一种分子量为180kd的同型二聚体膜蛋白，属于一种转化生长因子受体复合物（TGF-β），是血管生成过程之中不可或缺的成分。与其他内皮标记物不尽相同，Endoglin作为一种内皮细胞的表面标志物，仅在新生的血管内皮细胞中表达，即只有当肿瘤血管内皮细胞处于增殖状态时，才可以检测到Endoglin的高表达，而在正常组织的血管内皮细胞中是无法检测到的。相比CD31、CD34等内皮细胞表面标记物，Endoglin在肿瘤新生血管的检测中具有良好的特异性，其表达大多分布于肿瘤实质的边缘处，在正常组织的血管内皮细胞中无表达，且与肿瘤新生血管的生成密切相关。 目的：探讨Endoglin在肝癌组织及癌旁组织中的差异表达及临床意义；进一步研究Endoglin影响肝癌细胞增殖和迁移的相关机制，为今后肝癌的预防、治疗以及预后提供有参考价值的新思路。 方法：从广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科收取肝癌组织及癌旁，通过免疫组织化学方法对肝细胞癌患者肿瘤组织及癌旁组织进行Endoglin表达量的检测。应用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除人高转移性肝癌细胞系HCC-LM3进行Endoglin基因。运用Transwell细胞迁移实验、WoundHealing细胞划痕实验、细胞平板集落形成实验等检测Endoglin基因敲除后的LM3细胞生物学特性；通过裸鼠移植瘤实验观察Endoglin基因敲除后的LM3细胞在裸鼠体内的肿瘤形成及转移能力。体内实验分为Px458-sgRNA组（肿瘤局部注射Px458-sgRNA质粒载体进行治疗）、Px458-EGFP组（肿瘤局部注射Px458-EGFP重组质粒）、PBS组（肿瘤局部注射等体积PBS），通过比较三组小鼠肿瘤体积、重量的变化情况及生存曲线，观察Endoglin在小鼠体内被敲除后肿瘤生长状态的变化，以及体内转染CRISPR/Cas9敲除Endoglin基因质粒对小鼠肿瘤的治疗效果。 结果：在收集的肝癌肿瘤组织标本及癌旁组织标本中，Endoglin表达量存在明显差异，肿瘤组织中Endoglin表达量明显高于癌旁组织（P＜0.05）。在体外实验中，经过CRISPR/Cas9质粒系统（Px458质粒载体）瞬时转染LM3细胞后，体外验证敲除效率达到19.15%。Transwell迁移实验结果显示，LM3在敲除Endoglin基因后，迁移功能受到影响，迁移能力与野生型LM3相比明显降低（P＜0.05）；划痕实验结果显示敲除Endoglin后，LM3的增殖受到影响，愈合率明显降低（P＜0.05）；裸鼠体内荷瘤实验结果显示，Px458-sgRNA组肿瘤增长速度、肿瘤重量明显低于PBS组和Px458-EGFP组（P＜0.05），生存期明显延长；PBS组与Px458-EGFP组相比，各项指标均无明显差异（P＞0.05）。 结论：肿瘤新生血管标记物Endoglin在肝癌肿瘤组织中高表达；应用CRISPR/Cas9技术对高转移性人肝癌细胞系LM3进行Endoglin基因敲除后，其增殖及迁移功能显著降低。肿瘤细胞Endoglin基因敲除后能够明显抑制肿瘤在小鼠体内的生长速度及延长小鼠的生存时间。
肝细胞癌;Endoglin;细胞增殖;细胞迁移;局部敲除基因
广西医科大学
硕士
临床检验诊断学
赵永祥
2016
中文
R735.7
2022-04-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）