桑叶中隐绿原酸的抗炎活性及初步机制研究
桑是我国传统的药食两用的植物，含有丰富的黄酮类、多糖类、生物碱类、甾醇类、挥发油类、香豆素类、酚酸类、氨基酸和微量元素等有效成分，其生物活性极其丰富。隐绿原酸是桑叶中的酚酸类化合物，对于隐绿原酸的药理作用报道较少。本文研究了隐绿原酸对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞的抗炎活性，并且分析了隐绿原酸的抗氧化作用及分子机制，进一步明确了Nrf2/HO-1信号通路是隐绿原酸抑制脂多糖诱导细胞炎症的关键分子机制。 本文主要研究成果如下： 1.采用超声波提取法提取桑叶中的隐绿原酸。结果显示隐绿原酸的含量为0.286mg/g。将桑叶粗提物用不同极性的有机溶剂萃取确定隐绿原酸主要分布在正丁醇萃取层，利用高速逆流色谱方法对桑叶样品进行分离得到纯度为93%的隐绿原酸。 2.MTT实验结果表明：不同浓度脂多糖处理细胞12h时对细胞无显著毒性，不同浓度脂多糖处理细胞24h时，超过2μg/mL的脂多糖处理后，细胞活力显著下降。不同浓度脂多糖处理细胞48h时，仅在0.5μg/mL时细胞活力显著降低，因此，选取不同浓度脂多糖处理细胞24h进行后续实验。一氧化氮(NO)结果表明：在脂多糖1μg/mL作用于RAW264.7细胞24h后，一氧化氮含量最高，结合MTT实验结果，最终选用1μg/mL脂多糖处理细胞24h作为最佳造模条件。 3.隐绿原酸具有抑制RAW264.7细胞炎症反应作用。细胞活力分析结果表明：150μM的隐绿原酸对RAW264.7细胞有轻微毒性，100μM以内隐绿原酸对RAW264.7细胞的生存率没有显著的抑制作用。故选取100μM以内浓度进行实验。NO结果表明：隐绿原酸(20、40、80μM)可以抑制脂多糖引起的炎症产生，并且隐绿原酸提前预处理2h为加药的最佳条件。ELISA和Westernblot结果显示：隐绿原酸预处理，细胞内炎症因子iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6和TLR4含量显著降低(与模型组相比)。Westernblot同样表明：隐绿原酸也可以抑制脂多糖激活的p-IKK-α/β和p-IκB-α的磷酸化，抑制IκB-α蛋白降解，抑制NF-κB(p65)蛋白的核易位。 4.隐绿原酸可降低脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症反应中的氧化应激。检测隐绿原酸对细胞内抗氧化酶的影响。结果表明：隐绿原酸预处理后，RAW264.7细胞内谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)的活力具有显著的提升，而丙二醛(MDA)的水平显著的降低。此外，隐绿原酸能显著的减弱脂多糖引起的细胞内活性氧(ROS)产生，同时，促进细胞内核因子E2相关因子2(Nrf2)核易位和血红素加氧酶1(HO-1)蛋白水平的表达(同模型组比较)。采用Nrf2的抑制剂ML385提前处理细胞后，阻滞了隐绿原酸降低NO与炎症因子的作用。以上结果表明隐绿原酸可以激活Nrf2/HO-1信号通路抑制细胞炎症反应。 综上所述，桑叶中的隐绿原酸具有抗炎作用，并且隐绿原酸可以降低炎症反应中的氧化应激，揭示了Nrf2/HO-1通路在抗炎作用方面的潜力，为隐绿原酸治疗炎症性疾病等提供了科学依据。
桑叶;隐绿原酸;脂多糖;炎症反应;氧化应激;抗炎活性
东北林业大学
硕士
植物学
付玉杰
2021
中文
R284.1
2022-01-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）