基于Caco-2细胞模型的儿茶素转运和代谢机制研究
茶多酚是茶叶的主要活性成分，其中儿茶素类化合物是茶多酚的主要成分，约占其总量的70%至80%，具有抗氧化、抗突变、抗菌消毒等活性，并对多种疾病如癌症、心血管疾病、糖尿病等有预防作用。本文采用Caco-2细胞单层模型对八种儿茶素单体吸收、转运、代谢进行了系统的研究，为提高儿茶素生物利用度，提高儿茶素在人体内的生物活性打下基础。主要研究内容及结果如下： 1.Caco-2细胞模型的评价 本实验通过测定Caco-2细胞的跨上皮细胞电阻（TEER）、碱性磷酸酶活性和被动扩散标志物荧光黄的跨膜通量来评估和监测Caco-2细胞单层的完整性、细胞极性的形成以及细胞单层的通透性等来建立Caco-2细胞单层模型的标准。根据结果本实验以TEER大于500Ω·cm2（12孔transwell培养板或6孔transwell培养板）；荧光黄的表观渗透系数Papp值小于0.5?10-6cm/s；碱性磷酸酶活性AP/BL大于5为Caco-2细胞模型完整的标准，该条件下的Caco-2细胞单层模型可用来进行儿茶素的转运代谢实验。 2.儿茶素在Caco-2细胞中的转运及对Caco-2细胞中相关转运蛋白的影响 采用Caco-2细胞单层作为模拟小肠药物吸收的体外模型，研究儿茶素在小肠中可能的吸收和转运机制。结果发现，儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、没食子儿茶素（GC）、表没食子儿茶素（EGC）、儿茶素没食子酸酯（CG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）均可以直接透过Caco-2细胞单层，并且它们的表观渗透系数均＜1?106cm/s，提示儿茶素单体在人体的口服利用度较差。八种儿茶素单体从肠腔侧（AP侧）到浆膜侧（BL侧）转运量具有浓度依耐性，随浓度增加而增加，并且在200μmol/L至400μmol/L浓度范围内呈线性增加（r2≥0.96），表明儿茶素在Caco-2单层模型中的转运具有被动运输的特征。儿茶素在Caco-2细胞模型中的外排转运也呈现明显的浓度依赖和时间依赖，在浓度300μmol/L时呈现出饱和的趋势，外排的转运量显著大于吸收的转运量，各儿茶素的溢出率（ER）均大于2，认为儿茶素的转运存在外排转运蛋白的介导。使用多药耐药蛋白2（MRP2）抑制剂MK-571对儿茶素在Caco-2细胞单层的转运进行干预实验，结果发现MK-571的存在能够抑制儿茶素的外排转运，增加儿茶素的吸收转运，表明儿茶素可能是MRP2的底物。比较顺式儿茶素（EC、ECG、EGC、EGCG）和反式儿茶素（C、CG、GC、GCG）的双向转运特征，发现反式儿茶素的外排转运量均分别高于他们对应的顺式儿茶素，表明儿茶素的空间结构能够影响儿茶素在上皮细胞的跨膜转运。 采用荧光定量PCR和western blot技术来研究儿茶素对Caco-2细胞中相关转运蛋白的影响。结果发现，各儿茶素可以在转录和翻译水平上调MRP2的mRNA和蛋白的表达量，增加MRP2对儿茶素的主动外排，进一步降低儿茶素的口服利用度。儿茶素对多药耐药蛋白1（MRP1）在转录和翻译水平上的影响也表现出上调的趋势，但不同儿茶素对其的影响存在着较大的差异，其中C、EC、EGCG能显著（p＜0.05）上调MRP1在转录和翻译水平上的表达。此外，我们还研究了儿茶素对Caco-2细胞中的糖转运蛋白的影响，发现儿茶素可以显著（p＜0.05）下调钠依赖性葡萄糖转运体1（SGLT1）的mRNA和蛋白的表达量，从而降低SGLT1的活性，减少葡萄糖的吸收。儿茶素对于葡萄糖转运蛋白2（GLUT2）的影响受诱导时间的影响而表现出显著的差异性。使用儿茶素对Caco-2细胞进行2h诱导发现GLUT2在转录和翻译水平上的表达量均下降；但延长诱导时间至24h后，GLUT2的mRNA和蛋白的表达量均升高。 3.儿茶素在Caco-2细胞中的代谢 利用的LC/MS（负模式）和LC/MS/MS技术对儿茶素在Caco-2细胞单层中的代谢产物进行了研究。结果表明，代谢产物去质子化的质荷比（m/z）均较小，未发现m/z＞650的特征物质，说明儿茶素在肠上皮细胞内以简单代谢为主。比较各儿茶素及代谢产物的相对含量，发现八种儿茶素的硫酸化代谢产物含量均是最高的，故硫酸化是儿茶素在Caco-2细胞中生物转化的最主要的途径。儿茶素代谢产物中含量较高的是其甲基化代谢产物。在儿茶素的甲基化代谢产物中，相同的m/z能够提取到多个峰，表明存在多种结构的甲基化代谢产物，这可能与-CH4在儿茶素上的不同取代位置有关。在CG、GC、EGC和GCG的外排转运过程中还检测出儿茶素的甲基化硫酸盐代谢产物。 通过对比顺式儿茶素和反式儿茶素代谢产物的相对含量，发现在Caco-2细胞从底侧至顶侧的外排转运中，反式儿茶素的甲基化、硫酸化、甲基化硫酸化代谢产物的含量均高于顺式儿茶素，并且有较多的提取峰，表明反式儿茶素比顺式儿茶素有更广泛的代谢。儿茶素经过吸收转运和外排转运后的代谢产物存在着一定差异。非酯型儿茶素（C、EC、GC、EGC）经过吸收转运后得到的代谢产物跟外排转运得到的代谢产物基本相同，主要是硫酸化代谢产物，其次是甲基化代谢产物，但是含量远低于外排转运，表明儿茶素的代谢产物被大量外排至肠腔，只有少部分被吸收；酯型儿茶素（CG、ECG、GCG、EGCG）从顶侧至底侧转运后没有发现任何上述代谢产物，表明酯型儿茶素的代谢产物基本不被肠道吸收。儿茶素被人体吸收后在小肠上皮细胞中被广泛代谢，然后大量的儿茶素及其代谢产物被排至肠腔侧，降低了儿茶素的吸收，导致了儿茶素较低的口服利用度。
茶多酚;儿茶素类化合物;转运机制;代谢机制;生物利用度
华中农业大学
博士
茶学
倪德江
2018
中文
R282.71;R285
2022-01-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）