犬细小病毒的分离鉴定及抗体检测方法的建立
1982年，犬细小病毒2型（Canineparvovirus2，CPV-2）发现于美国，是犬和野生动物出现高发病率和死亡率的主要原因之一。为调查犬细小病毒（Canineparvovirus，CPV）流行株的遗传变异情况，本试验从吉林省某比格犬养殖场采集2份疑似CPV感染致死犬的肠道组织和肛拭子。将病料过滤除菌后，接种至F81细胞进行分离，采用电镜、PCR、免疫荧光及动物试验鉴定分离到的病毒。结果显示，分离的病毒感染F81细胞后，细胞呈现典型的CPV细胞病变（CPE）；电镜观察可见病毒粒子无囊膜、直径为20nm左右；PCR结果显示2株病毒均为CPV阳性，分别命名为JL-(18)1/Beagle和ZJ-LX；免疫荧光试验结果证明2株犬细小病毒均能与CPV单克隆抗体结合产生绿色荧光；动物试验结果显示JL-(18)1/Beagle和ZJ-LX均能感染比格犬，并使比格犬产生典型犬细小病毒感染的临床症状。利用DNAstar对JL-(18)1/Beagle和ZJ-LX的VP2氨基酸位点进行分析，结果显示JL-(18)1/Beagle属于NewCPV-2b型，ZJ-LX属于CPV-2型。JL-(18)1/Beagle与NewCPV-2b型CPV/CN/JL3/2013、CPV/CN/HB1/2013和CPV/CN/JL6/2013亲缘关系较近，ZJ-LX的VP2基因与河北省的貉源犬细小病毒共享同一进化分支。与近期吉林省的CPV分离株相比，JL-(18)1/Beagle的关键氨基酸位点无明显变化；而ZJ-LX的4个氨基酸位点I219V、N375D、V562L和Y573F与原始CPV-2相比发生了突变，此外，还发现ZJ-LX的NS1基因出现了T714C和A1098G2个新的核苷酸突变。 针对ZJ-LX株设计含有EcoRI和HindⅢ酶切位点的特异性引物，扩增ZJ-LX株的VP2基因。将VP2基因的PCR扩增产物纯化后与pET-30a载体双酶切并连接，构建了重组原核表达质粒pET-30a-VP2。将其转化至E.coliBL21（DE3），经IPTG诱导后，收集表达的重组蛋白，经SDS-PAGE分析，发现诱导剂浓度为0.5mmol/L，诱导温度为37℃，诱导时间为4h，VP2的蛋白表达量最大。采用优化后的条件诱导pET-30a-VP2蛋白的表达并纯化，利用Westernblotting对重组蛋白进行鉴定，结果显示pET-30a-VP2重组蛋白可分别与His和VP2单克隆抗体发生反应，说明pET-30a-VP2重组蛋白具有良好的反应原性。 本研究利用纯化后的pET-30a-VP2重组蛋白作为包被抗原，建立检测CPV抗体的间接ELISA方法，通过筛选该方法的各项反应条件，优化检测方法。评估其特异性、敏感性和重复性，并对该方法进行了初步应用。结果显示CPV抗体间接ELISA方法的最佳抗原包被浓度为6.5μg/mL，最佳抗原包被时间为12h，最适宜的封闭液为5%脱脂乳，一抗的工作浓度为1∶16000倍稀释，最佳孵育条件为37℃，1h，二抗的最佳孵育条件为37℃，1h。特异性试验结果显示该间接ELISA方法能够特异地检测CPV抗体，与CAdV-1和CDV的阳性血清无交叉反应。批间和批内重复性的变异系数均低于10%；能检测到最低浓度为0.03μg/mL的VP2单克隆抗体；与中和试验（SN）对比结果显示其敏感性为91.2%，特异性为80%，符合率为89.7%，本试验为评估犬细小病毒疫苗的保护效果提供技术手段。
犬细小病毒;分离鉴定;ELISA;检测方法
吉林农业大学
硕士
野生动植物保护与利用
王全凯;朱言柱
2021
中文
S852.655
2022-01-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）