大肠杆菌中反式-4-羟基-L-脯氨酸合成途径模块化重构和优化的研究
反式-4-羟基-L-脯氨酸是一种重要的氨基酸，广泛应用于医药、食品和化妆品等领域。作为多种药物（尤其是碳青霉烯类抗生素）合成的中间体，反式-4-羟基-L-脯氨酸的市场需求日益增长，其制备和生产技术的开发也引起了越来越多的重视。 在本课题研究中，一种多元模块化代谢工程方法被用于重构并优化大肠杆菌的反式-4-羟基-L-脯氨酸合成途径，以拓展其合成通路瓶颈，并提高反式-4-羟基-L-脯氨酸产量。基于反式-4-羟基-L-脯氨酸生物合成途径架构，以α-酮戊二酸和L-脯氨酸两个关键中间产物作为代谢节点，将大肠杆菌反式-4-羟基-L-脯氨酸生物合成分为三个模块：α-酮戊二酸合成模块、L脯氨酸合成模块和L-脯氨酸羟基化模块。分别对这三个模块的代谢途径进行重构和调试，然后将优化后的三个代谢通路进行组合和再平衡优化，从中选择最佳的组合，构成完整的反式-4-羟基-L-脯氨酸合成途径。主要工作如下： 在α-酮戊二酸合成途径中，本课题通过删除酮戊二酸脱氢酶和异柠檬酸裂解酶来减少α-酮戊二酸的损耗，通过引入谷氨酸氧化酶（LGOX），加强异柠檬酸脱氢酶（ICD）、柠檬酸合成酶（CS）和乙酰辅酶A合成酶（ACS）的表达以增加α-酮戊二酸的代谢通量，从而达到增加α-酮戊二酸积累的目的。 在 L-脯氨酸积累途径中，本课题通过删除脯氨酸脱氢酶，引入或加强表达耐反馈抑制的γ-谷氨酸激酶突变体（ProB74）、γ-谷氨酰磷酸还原酶（ProA）和吡咯啉-5-羧酸还原酶（ProC）来拓展L-脯氨酸合成通路，从而增加L-脯氨酸的积累量。结果，经α-酮戊二酸和L-脯氨酸代谢途径的组合修饰使反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量达到了8.09 g/L，是初始菌株产量的2.8倍。 在优化脯氨酸羟基化方面，采用了启动子、融合表达等不同手段来评估对羟化酶表达的影响，发现用麦芽糖结合蛋白（ MBP）融合标签来表达Dactylosporangiumsp. RH1菌株来源的脯氨酸羟基化酶基因（p4h）效果最佳， L-脯氨酸羟基化酶活达到了4218 U g-1细胞干重，是初始酶活的3.9倍。 在以上三个模块分别优化的基础上，为了增加质粒在大肠杆菌中的稳定性，将脯氨酸合成模块和脯氨酸羟基化模块合并为一个模块。然后，通过采用不同的启动子组合优化上述两个模块，从转录水平平衡α-酮戊二酸、脯氨酸代谢流和脯氨酸羟基化率，有效的提高了反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量。最终，当培养基中额外添加5 g/L的谷氨酸钠时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的摇瓶产量和产率分别达到了8.80 g/L和0.24 g/g葡萄糖，分别是初始菌株产量和产率的3倍和3.4倍。本研究为构建出高效合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的通用底盘细胞奠定了基础。
反式-4-羟基-L-脯氨酸;合成途径;模块化重构;代谢流平衡;大肠杆菌
浙江工业大学
博士
药物化学
苏为科;储消和
2021
中文
R977.4
2021-12-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）