赭曲霉P450单加氧酶的定点改造及功能分析
11α-羟基坎利酮是合成对心血管具有保护作用的依普利酮的医药中间体，是制备依普利酮的关键步骤。本实验室分离获得的一株赭曲霉MF016菌株中存在细胞色素P450（CYP）酶系统，可转化坎利酮生成11α-羟基坎利酮，但转化率较低。且该酶菌产生的次级代谢产物——赭曲霉毒素（OTA）具有强烈的肝脏和肾脏毒性以及潜在的致癌和突变能力，严重制约了其在制药和食品等相关领域的应用。提高赭曲霉对甾体类药物的催化效率一般需从发酵条件优化和菌株改造两个方面进行。目前，有关赭曲霉催化甾体类药物发酵条件优化的研究已有不少，但对赭曲霉菌株的定向改造报道不多见，而后者才是提高甾体催化效率的关键和技术难点。 为了获得一株高表达CYP单加氧酶而又失去产OTA能力的赭曲霉基因工程菌株，本研究利用测序平台PacBioSMRT对赭曲霉MF016进行全基因组测序与注释，获得赭曲霉菌株MF016全基因组信息（GenBankNo.VBTP00000000）。根据已报道的两个与OTA合成相关的聚酮合酶基因（pks）序列信息，预测了赭曲霉MF016的两个聚酮合酶基因pks1和pks2，并选择pks2为待敲除基因。根据pks2序列设计PCR扩增引物，克隆了pks2基因的片段pks2-ud，并插入大肠杆菌-赭曲霉穿梭载体pBC-hygro构建重组质粒pB-pks2-ud。进一步在质粒pB-pks2-ud上的pks2-ud基因片段中插入带有Tr启动子和终止子序列的博莱霉素抗性基因，构建重组质粒pB-p1zp2。制备赭曲霉MF016原生质体，通过PEG介导将重组质粒pB-p1zp1转入赭曲霉MF016原生质体，经同源重组敲除pks2基因，获得了失去产OTA能力的突变菌株赭曲霉菌MF018。 在此基础上，根据已报道的CYP单加氧酶基因序列信息，预测并克隆了赭曲霉MF018的细胞色素P450单加氧酶基因。利用融合PCR技术依次构建赭曲霉细胞色素P450单加氧酶上游同源臂、启动子序列、赭曲霉细胞色素P450单加氧酶基因、潮霉素抗性标记基因和赭曲霉细胞色素P450单加氧酶下游同源臂融合DNA序列（命名为UTPHD）。将融合DNA序列UTPHD插入质粒pBC-hygro构建重组质粒pB-UTPHD。以赭曲霉MF018为出发菌株制备原生质体并将pB-UTPHD转化入原生质体，经同源重组获得了高表达CYP单加氧酶的重组菌株赭曲霉MF010。该重组菌株在不添加任何有机溶剂和表面活性剂的条件下，60h底物坎利酮转化率可达到约93%。原始赭曲霉菌株MF016的底物坎利酮转化率在96h才达到75%。重组菌MF010的最高转化率比原始菌MF016高出17-18%，且转化时间缩短了30h以上。以上结果表明赭曲霉重组菌MF010与原始菌MF016相比转化坎利酮生成11α-羟基坎利酮效率大大提高，转化时间显著缩短，且无产OTA能力。 11α-羟基坎利酮是甾体化合物坎利酮半化学合成依普利酮的限制因素，本研究提供的重组菌株MF010可以高效转化坎利酮生成11α-羟基坎利酮，且不产生OTA，较好克服上述瓶颈的同时又从源头上解决了OTA污染问题，为依普利酮的工业化生产奠定基础。
赭曲霉;P450单加氧酶;赭曲霉毒素A;11α-羟基坎利酮;定点改造
上海应用技术大学
硕士
生物化工
李茜茜
2020
中文
TQ460.1;Q78
2021-11-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）