乳化作用对生物制备γ-癸内酯的抑制机理初探
天然香料γ-癸内酯（gamma-decalactone,GDL）在低浓度时具有诱人的桃香香气，是一种公认的安全食品、药品添加剂。目前利用微生物转化法生产天然GDL是研究热点，以弥补传统的天然提取法产量低下的缺点，具有广泛的研究前景。由于常用的生物转化体系中底物为蓖麻油酸，与培养基形成典型的油水两相转化体系，在转化后期乳化现象严重。因此，本文对酿酒酵母转化蓖麻油酸过程中，转化体系自动乳化规律和油滴尺寸变化与GDL生产速率的关系进行研究；考虑到产物本身对细胞的抑制作用，通过细胞转录组分析和基因功能分析，对酿酒酵母在GDL胁迫下的分子应激机制有了更多的认识，为高效进行生物转化生产GDL奠定理论基础；采用一种新型生物材料对菌体进行固定包埋，为提高菌体在乳化体系中的生物转化效率提供了一种新方法。 首先，根据蓖麻油酸的性质，建立了蓖麻油酸衍生化气相检测的方法，该方法的回收率实验结果表明其准确性高，且相比大部分衍生化检测方法，该方法操作较为简单，检测时间较短。研究过程中发现酿酒酵母在油水两相中能产生环状脂肽生物表面活性剂，其促进了油相乳化的形成；乳化过程中，形成的油滴粒径尺寸在2000nm左右波动；在24-30hGDL生成率较高的时候，粒径在500-4500nm内有大波动；当蓖麻油酸的初始液滴粒径约为3000nm，GDL的最快生产速率时间提前了12h；转化48h时，转化后期的细胞活性有很大的毒害作用，体现了乳化体系转化的弊端。 为探索酿酒酵母对GDL耐受性能的分子作用机制，将GDL胁迫处理后酿酒酵母细胞进行转录组测序分析（RNA‐Seq），分析结果表明处理细胞共有3865个显著差异表达基因，其中有1991个基因表达上调，1861个基因表达下调。对这些显著差异性表达基因的KEGGPathway富集分析表明，GDL胁迫对酵母细胞中蛋白质加工合成过程和能量代谢方面造成一定压力。在GDL胁迫下，就细胞膜和细胞壁以及内质网这三个方面应对胁迫的响应机制为：一是通过降低脂肪酸酰基链的合成长度和降低胞内磷脂酰乙醇胺/磷脂酰胆碱（PE/PC）的比例，来增加细胞膜的流动性。引起细胞质膜上能量依赖型的ATP结合盒（ABC）转运蛋白的高表达，从而达到外排胞内毒性物质的作用；二，GDL刺激信号通过与细胞表面感应因子Wscl-3p、Mid2p与Rho1p蛋白协作，激活了丝裂原活化蛋白激酶MAPK通路，该通路诱导CWI通路相关基因调控细胞壁重构。丝裂原活化蛋白激酶MAPK还可通过信息素通路和渗透通路使得细胞周期蛋白依赖性激酶的表达下调，减缓细胞周期，从而减轻DNA复制和细胞壁合成压力；三，内质网中通过激活启动UPR元件，使得KAR2、LHS1、PDI1、FKB2、AIM17的高度表达来缓解错误折叠或者未折叠蛋白造成的内质网应激压力,保护细胞免于ERS所致的细胞损伤。 采用安全无毒害的生物材料细菌纤维素和海藻酸钠的复合材料为载体，固定化菌体细胞，以抑制高浓度产物的毒害作用。实验结果表明，用该方法制备的BC-ALG载体可重复使用至少5次，得到的最大GDL浓度为8.37g/L，比游离细胞体系中高21%，约为ALG固定化细胞的3.7倍载体。
γ-癸内酯;蓖麻油酸;转录组;乳化作用;抑制机理
上海应用技术大学
硕士
生物化工
张硕
2020
中文
TQ654
2021-11-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）