DNA熔解温度测定和改善芯片杂交差异的研究
核酸的熔解温度（Tm）值的准确测定是分子生物学实验DNA杂交方法建立的基础，同时Tm值对基因芯片的研究亦有重要意义。本文提出DNA片段Tm值的荧光测定方法，较传统紫外法具有溶液需求量小，操作简便，抗干扰，可测定不同长短、不同GC%含量DNA片段的Tm值。利用Zn2+与甜菜碱的组合作用，在较低粘度条件下建立了使不同GC%含量DNA片段在同一条件下进行杂交的缓冲体系，并用基因芯片进行验证。优化了基因芯片的杂交条件，为实现基因芯片的高通量研究提供了一种方法。 1.利用荧光实时定量PCR仪（RT-PCR），考察了荧光法测定不同GC%、不同长短DNA片段Tm值实验条件的影响。使用的溶液条件为DNA溶液（终浓度10ng/μL）、SYBRGreenⅠ稀释液量1μL、磷酸盐溶液（终浓度5mmol/L）、Tris盐溶液（终浓度60mmol/L），总的实验体系为40μL。荧光定量RT-PCR仪测定程序为30℃30s，65个循环，每个循环加1℃。结果，测定不同GC%、不同长短DNA片段Tm值分别为lambdaDNA为87℃，不同GC%含量150~300bp（TPMT、CY、APOE）的Tm值为72℃、78℃、90℃，25bp的Oligo小片段（A、B、C）的Tm值为（43℃、67℃、gt;90℃）。相同实验条件下，紫外法测定DNA片段的Tm分别为lambdaDNA为89℃、不同GC%含量150~300bp为70℃、79℃和gt;90℃。选择的荧光定量法实验条件可以准确测定不同GC%含量、不同长短DNA片段的Tm值，与紫外法测定的结果基本一致。 2.建立了使不同GC%含量DNA片段在同一杂交温度、同一基因芯片上进行正确杂交的低粘度缓冲体系。在荧光法测定DNA片段熔解曲线的基础上，研究加入Zn2+和甜菜碱后不同GC%含量DNA片段解链温度的变化。根据解链温度变化，选择Zn2+浓度为10-4mol/L~10-2mol/L，甜菜碱的浓度1.5mol/L~2.5mol/L，加入基因芯片杂交缓冲体系中，并在基因芯片上固定GC%含量为15%、50%和80%的20bp三种DNA探针以及相应有一个碱基突变的另外三种探针，突变探针的GC%含量分别为10%、55%和75%。选定杂交温度为31℃，用靶序列与基因芯片进行杂交实验。结果，杂交体系中同时含有浓度为10-3mol/L的Zn2+离子和浓度为2.5mol/L的甜菜碱时，粘度较低，可以消除突变探针杂交非特异信号，特异性信号明显、均匀，达到了使不同GC%含量的DNA片段在同一张芯片、同一温度条件下进行准确杂交的预期目标。
DNA熔解温度;荧光定量PCR;基因芯片;甜菜碱;锌离子
上海应用技术大学
硕士
应用化学
朱滨;许旭
2017
中文
Q503
2021-11-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）