基于Snoopligase制备抗TNFα和IL17A双特异性纳米抗体及其应用研究
炎症性疾病严重威胁人类健康，其中类风湿性关节炎作为最常见的全身性自身免疫性疾病之一，发病率在0.5%-1%。研究表明，以肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor,TNFα）为靶点的单克隆抗体药物在治疗上有局限性，白介素17A（Interleukin17A,IL17A）为补充靶点的双特异性抗体药物有希望弥补单一靶点药性不足的问题。一直以来，对双特异性抗体的研究从未停止，通过基因工程串联两个抗体基因并表达，制备C-N连接方式的双特异性抗体，会干扰其对抗原的结合活性。酶催化如转肽酶或谷氨酰胺转移酶可用于蛋白质的表达后偶联，制备的双特异性抗体可能存在均质性差等问题。纳米抗体具有良好的稳定性、抗原结合活性，且以纳米抗体作为亲和配基的免疫吸附材料的出现，更为炎症性疾病的治疗提供了一种新的思路。本论文报道一种一锅法制备和固载双特异性纳米抗体的方法：基于Snoopligase与底物稳定结合的性质，将Snoopligase固载至双环氧活化的琼脂糖凝胶上，与加有反应标签的抗TNFα和IL17A的纳米抗体反应，制备免疫吸附剂，并评价其在溶液环境中吸附抗原的能力，此外通过对载体洗脱可制备游离的双特异性纳米抗体（Bis-Nb），并对其进行评价。具体研究内容如下： （1）大肠杆菌发酵表达蛋白质MBP-SnoopTagJr、eGFP-DogTag、Nb TNFα-DogTag、Nb IL17A-SnoopTagJr和Snoopligase。经镍柱纯化后纯度均在90%以上。使用模式体系对Snoopligase反应验证，并优化反应的pH、甘油浓度、反应温度、反应时间，发现在pH为8.25并含有30%甘油的三乙醇胺（TEAM）溶液，于4℃下孵育反应20h，可得到70%的产物生成。 （2）双环氧活化的琼脂糖凝胶CL6B环氧密度为40μM/mL胶，Snoopligase的固载量为28.6mg/mL胶。且相较于第一次，固定化Snoopligase在10次重复使用中均表现出90%产物的生成。使用pH1.5甘氨酸盐酸对非均相反应后载体洗脱，准确制备了纯度在90%以上，具有抗原结合活性且可同时结合两个抗原，亲和力与单独纳米抗体相当的Bis-Nb，其可以有效地抑制因炎症因子TNFα和IL17A引起的类风湿性关节炎患者关节处成纤维细胞（RA-FLS）的异常增殖与迁移。 （3）对双特异性纳米抗体免疫吸附剂稳定性评价表明，在温和的溶液环境条件下，吸附剂的配基不会脱落，且其可以在含0.02%叠氮钠的PBS溶液中稳定保存13天。在PBS溶液环境下的标准静态吸附评价表明，免疫吸附剂对抗原TNFα的饱和吸附量为2.3mg/mL，对IL17A的饱和吸附量为2.1mg/mL。 综上所述，本论文提供了一种基于Snoopligase制备双特异性纳米抗体及双特异性免疫吸附剂的方法，为双特异性蛋白质的制备以及Snoopligase的应用提供了一种新的策略。相信本论文中制备的双特异性纳米抗体及吸附剂对由炎症子引起的疾病有良好的治疗潜力。
双特异性纳米抗体;肿瘤坏死因子α;白介素17A;制备工艺;抗炎症作用
大连理工大学
硕士
生物化工
贾凌云
2021
中文
TQ464.7
2021-12-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）