微结构丝素蛋白薄膜的仿生制备及其在肌腱修复中的应用
随着运动健身的普及，越来越多的人开始进行体育锻炼，但由于人口老龄化及不正确的运动姿势，肌腱损伤发病率也逐年增加。常见的肌腱损伤包括肌腱病、肌腱撕裂/断裂伤等。肌腱损伤的治疗方式主要包括非手术治疗和手术治疗，非手术治疗一般适用于轻度损伤且效果有限，手术治疗包括残端清理缝合、自体或异体腱移植替代等，取得了广泛的疗效。由于肌腱的特殊生物学性能及愈合机制，损伤肌腱的愈合结果通常为瘢痕组织形成。不同于肌腱的原生基质结构，瘢痕组织基质内的胶原纤维呈无序排列，生物学功能较差且易发生二次损伤。 组织工程是新兴的组织修复方法，其目的是通过生物材料促进组织原生结构的有效修复，研究内容包括种子细胞、支架材料及支架-细胞复合体构建三个方面。肌腱修复中，来自内源性修复细胞的肌腱干/祖细胞（TSPCs），在肌腱修复中起到关键作用，是肌腱组织工程中常用的种子细胞。支架材料的制备是组织工程需着重考虑的因素。多种生物材料被用于肌腱修复研究，主要可分为天然材料及人工材料，天然材料生物毒性较小但其力学强度低，可加工性较差；人工材料虽易于制备且具有较好的力学性能，但其生物相容性较差，在体内存在潜在毒性。 近年研究发现，丝素蛋白薄膜生物支架具有较好的生物相容性、可塑性及可控的力学强度，被应用于角膜、神经等组织修复并取得较好的效果，是软组织修复中优良的组织工程材料，在肌腱修复中具有较高的潜在价值，但还未得到深入研究。将丝素蛋白薄膜用于肌腱修复，需要使丝素蛋白薄膜具有与原生肌腱相似的微环境，才可有效提升其生物学功能最终促进肌腱修复。早期研究多以生物支架交联大分子活性基团（如生长因子）作为主要方法，但存在易失活、不稳定的缺点。近年组织工程研究指出，当生物支架具有与组织相似的物理性质（力学、硬度等）和微结构时，可有效促进组织修复。在丝素蛋白薄膜支架表面制备仿生物理微结构，是提升其生物学性能的有效方法且具有高稳定性和精准性的优点。 以原生肌腱物理性质及微结构为参考，仿生制备具有生物功能的微结构丝素蛋白薄膜，对肌腱修复具有重要的应用价值。本研究首先分析了肌腱的微观结构及力学特点作为丝素蛋白薄膜生物支架的参考依据；然后仿生制备微结构丝素蛋白薄膜并观察其在体内对损伤肌腱的修复作用；最后在体外实验中探究微结构丝素蛋白薄膜对TSPCs的生物学调控作用及相关分子通路，综合评估微结构丝素蛋白薄膜在肌腱修复中的应用价值，为肌腱修复提供新的思路。 1.肌腱显微结构与力学性能分析 1.1方法 1.1.1通过扫描电镜和苏木精-伊红染色观察肌腱组织微结构，并对胶原纤维宽度进行分析对比。 1.1.2测试肌腱的生物力学特点。 1.2结果 1.2.1肌腱外观呈亮白色，触之质地紧实，韧性强，静息状态下呈蜷屈状，受到力后会随之伸展拉长，外观相对静息时更为细长且去除拉伸力后可恢复原有形态。 1.2.2通过SEM观察肌腱，低倍放大时（50X）可见肌腱表面的结构致密，胶原纤维束在肌腱表面呈现褶皱样形态；放大100-500倍可见胶原纤维平行排列的胶原纤维束；放大倍数2000X-10000X可见胶原纤维由纳米级纤维丝构成。 1.2.3HE染色可见胶原纤维呈均为长条索状，粗细不一的胶原纤维在肌腱中呈平行排列；肌腱固有细胞具有相似的形态及排列特点。 1.2.4胶原纤维的宽度主要分布在5-10μm，部分胶原纤维宽度小于5μm或大于15μm。 1.2.5随着拉伸应力不断增加，肌腱中纤维丝、胶原纤维及纤维束被拉伸到极限载荷；随着进一步被动拉伸肌腱组织会分离断裂，应力数值归于初始值。 1.3结论 1.3.1肌腱由纳米级纤维丝排列形成的胶原纤维束，狭长的固有细胞夹杂在其中，纤维束直径主要分布于5-20μm之间且5-10μm区间占比最多。 1.3.2肌腱样本的力学性能与其形变呈正相关。 1.3.3肌腱纤维的形态及力学数据，作为微结构丝素蛋白薄膜材料制备的参考依据。 2.仿生丝素蛋白薄膜支架的制备、改性与表征 2.1方法 2.1.1提取再生丝素蛋白溶液，参考1.3.3小节结果仿生制备具有不同微结构的丝素蛋白薄膜，水退火处理对材料进行改性处理。 2.1.2傅立叶红外光谱仪（FTIR）检测丝素蛋白薄膜材料内的蛋白构象变化。 2.1.3原子力显微镜（AFM）检测丝素溶液及丝素蛋白薄膜的物理特性。 2.1.4扫描电镜（SEM）观察丝素蛋白薄膜表面微结构形态。 2.1.5拉伸测试检测改性后不同微结构丝素蛋白薄膜的力学特性。 2.2结果 2.2.1丝素蛋白溶液的质量分数为4.53±3.4%，AFM显示丝素蛋白溶液内丝素纤维丝平行致密排列。 2.2.2制备了不同表面结构的丝素蛋白薄膜，结构完整无皱缩及气泡，改性后薄膜材料的物理性质发生显著改变。 2.2.3水退火处理后丝素蛋白薄膜内部β片层蛋白构象显著升高。 2.2.4AFM发现丝素蛋白薄膜支架经水退火改性后表面会出现纳米级粗糙结构。 2.2.5SEM观察到丝素蛋白薄膜表面微结构形态清晰且符合仿生设计尺寸。 2.2.6无微结构与5μm微结构丝素蛋白薄膜的力学性能较低，10、15和20μm微结构丝素蛋白薄膜的最大抗拉强度与原生肌腱相似，但在拉伸过程中会提前达到最大载荷。 2.3小结 2.3.1再生丝素蛋白溶液性质稳定，以之为原料制备的丝素蛋白薄膜形态完整，水退火改性后支架的物理性质显著提升。 2.3.2改性后丝素蛋白薄膜内部β-片层蛋白构象显著增加，材料表面会出现纳米级粗糙结构。 2.3.3微结构为10、15、20μm的丝素蛋白薄膜具有较好的力学性能。 3.微结构丝素蛋白薄膜在体内对损伤肌腱的修复作用 3.1实验方法 3.1.1建立大鼠跟腱损伤模型：正常组（N）、缺损组（D）、异体腱替代组（R）、无微结构丝素蛋白薄膜组（S）、微结构丝素蛋白薄膜组（G）。 3.1.2应用MRI、苏木精-伊红及免疫组化染色分析微结构丝素蛋白薄膜在体内对损伤肌腱的修复作用。 3.2实验结果 3.2.1D组跟腱组织的宽度及厚度明显高于其它组，S组与R组样本宽度及厚度低于D组，G组样本的宽度及厚度最低。 3.2.2MRI脂肪抑制像示：术后第4周R组、D组和S组均以炎性高信号为主，R组中可见异体腱低信号，G组可见少量不连续低信号；8周后D组仍以炎性高信号为主，R组异体腱两端呈炎性高信号，S组和G组均可见连续低信号，但S组信号连续性低于G组。 3.2.3组织学染色示：D组纤维形态紊乱且再生相关标志物的表达量较低；R组移植腱的纤维结构与原生纤维不连续，肌腱分化标志物表达量较低；S组胶原纤维形态相比D组中相对有序，修复区两端两端纤维与原生纤维少量连续，肌腱蛋白C（TNC）和腱调蛋白（TNMD）表达轻度升高，但与R组无明显差别；G组胶原纤维排列最为有序且肌腱修复标志物TNC、TNMD和一型胶原蛋白（COLIA1）显著高于其它组。 3.2.4组织学综合评分：G组显著高于其它组，S组与R组无明显差别，D组评分最低。 3.3小结 3.3.1微结构丝素蛋白薄膜可以减轻肌腱修复中的瘢痕增生，促进胶原纤维的有序形成及肌腱标志物的表达。 4.微结构丝素蛋白薄膜对TSPCs生物学行为的调控及分子机制 4.1微结构丝素蛋白薄膜对TSPCs生物学行为的调控 4.1.1实验方法 4.1.1.1提取原代TSPCs，通过免疫荧光及诱导分化染色鉴定其干/祖细胞特性。 4.1.1.2将TSPCs与支架材料共培养后，活死细胞荧光共染观察丝素蛋白薄膜的细胞相容性，CCK-8监测细胞的增殖活性。 4.1.1.3细胞骨架及细胞核双荧光染色观察TSPCs的细胞形态及空间排列。 4.1.1.4聚合酶链式反应(PCR)分析TSPCs在不同材料组中肌腱分化标志物表达量差异。 4.1.2结果 4.1.2.1TSPCs表面标志物CD3及CD34阴性，CD44和CD90呈阳性；经过分化诱导培养后，TSPCs分别向脂肪系、骨系和软骨系分化。 4.1.2.2微结构丝素蛋白薄膜表面的TSPCs生存能力良好，不同组间内TSPCs的增殖能力无显著差异。 4.1.2.35μm及10μm微结构丝素蛋白薄膜表面TSPCs呈现与原生肌腱中相似的细窄形态及空间排列，肌腱标志物基因表达也显著升高，当微结构为10μm时更为显著。 4.1.3小结 4.1.3.1丝素蛋白薄膜具有良好的生物相容性，微结构的加入不会影响TSPCs的细胞活性。 4.1.3.210μm微结构丝素蛋白薄膜可显著改变TSPCs细胞形态和空间排列，并通过磷酸化黏着斑激酶（FAK）促进TSPCs朝向肌腱系分化。 4.2微结构丝素蛋白薄膜调控TSPCs的内在分子机制 4.2.1实验方法 4.2.1.1mRNA转录组学及蛋白组学高通量测序，分析TSPCs内差异基因和蛋白的表达情况。 4.2.1.2WB对比分析关键通路分子的蛋白表达量。 4.2.2实验结果 4.2.2.1聚类分析提示差异表达的基因和蛋白在功能及定位上具有协同性。 4.2.2.2GO分析提示差异基因及蛋白本体功能差异性主要包括：①细胞生理功能（BiologicalProcess，BP):迁移、粘附及表面蛋白定位；②基因分子功能（MolecularFunction，MF):结合肌动蛋白丝和肌动蛋白；③细胞成分（CellularComponent，CC):肌动蛋白细胞骨架、肌动蛋白丝、应力纤维丝。 4.2.2.3KEEG富集分析提示差异变化集中在FAK-Actin信号通路和PI3K-AKT信号通路。 4.2.2.4微结构10μm的丝素蛋白薄膜支架可促进TSPCs肌腱标志物SCX、TNC、TNMD及COLIA1的表达，黏着斑激酶（FAK）的磷酸化激活具有关键作用；TSPCs中整合素分子α2β1蛋白表达量显著升高；磷酸化PI3K和AKT（308/473）与肌腱标志物TNC和TNMD显著升高；在加入PI3K-AKT通路抑制剂后，TNC和TNMD的表达会同时被抑制。 4.2.3小结 4.2.3.1整合素α2β1作为TSPCs的膜下微环境感受器，负责感知微结构丝素蛋白薄膜支架中的物理信号并传递到细胞内。 4.2.3.2微结构丝素蛋白薄膜通过FAK-Actin及FAK-PI3K-AKT分子途径协同调控TSPCs细胞骨架蛋白的重塑。 4.2.3.3微结构丝素蛋白薄膜通过FAK-PI3K-AKT分子信号通路诱导TSPCs成肌腱分化。
肌腱修复;组织工程;丝素蛋白薄膜;微结构;信号通路
陆军军医大学
博士
外科学(骨外)
唐康来
2021
中文
R686.1;R318.08
2021-12-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）