小鼠胚胎干细胞分化形成内耳祖细胞的诱导条件优化的研究
耳聋是人类最常见的由感音神经性损伤引发的疾病，该病影响着全球6%以上的人口，造成了严重的社会和经济影响。耳聋疾病的主要原因是内耳毛细胞的缺失或损伤，次要原因是内耳感觉神经元受损。作为终末分化的细胞，内耳毛细胞和感觉神经元在受损后无法再生，这使得耳聋疾病难以得到有效的治疗。目前，改善听力常通过佩戴助听器、人工耳蜗等方式实现，但这些设备改善听力的基础是：耳聋患者耳蜗中仍然存在一定量的毛细胞和感觉神经元。干细胞疗法为根治耳聋疾病提供了一条有效途径。胚胎干细胞具有无限增殖和分化为多种细胞类型的潜力，体外将胚胎干细胞诱导分化为多种内耳细胞类型，这些新生的细胞用以替代哺乳动物体内先天缺失或是损伤的内耳细胞，可以达到内耳功能的恢复。因此，利用干细胞疗法治疗耳聋疾病的过程中，如何通过体外诱导得到大量且稳定的内耳细胞至关重要。 本研究以小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cell，mESC）为实验材料，成功构建出体外诱导mESC高效分化为内耳祖细胞的MC3T3诱导体系，从内耳祖细胞中分离并富集耳上皮祖细胞（oepithelial progenitor，OEP）和耳神经祖细胞（otic neural progenitor，ONP），并构建了高效诱导OEP分化为类毛细胞的体系。首先，我们将mESC制备成104cells的拟胚体，用MC3T3条件培养液诱导拟胚体7d，通过免疫荧光等实验确定分化出的细胞为高表达Pax2、Pax8和Nestin内耳祖细胞。其次，我们通过设置不同的接种密度以及用耳干细胞全培养液培养内耳祖细胞，确定以6×104个/cm2密度接种的细胞为高表达Nestin基因的ONP细胞，以10×104个/cm2密度接种的细胞为高表达Pax2和Pax8基因的OEP细胞。我们还在耳干细胞全培养基中扩增OEP和ONP，确定OEP在扩增过程中仍可稳定高表达其标志性基因和蛋白，并发现第二代的OEP最适于后续的诱导分化为类毛细胞的实验。最后，我们用MC3T3条件培养液诱导OEP细胞6d，通过免疫荧光等实验确定分化所得的细胞为高表达Brn3c、Math1和MYO7A的类毛细胞。同时，我们还通过FM1-43和MYO7A的双染实验确定本研究分化所得的类毛细胞也许具备了初步的电生理功能，通过扫描电镜实验证明分化所得的类毛细胞表面具有丰富的不成熟的杂乱纤毛结构。 总之，本研究成功构建了将mESC高效地诱导分化为内耳祖细胞和类毛细胞的MC3T3诱导体系，并确定了从内耳祖细胞中分离OEP和ONP的具体方法。本研究的诱导时间短、诱导效率较高且诱导方式简单，可以为干细胞疗法治疗耳聋疾病提供大量且稳定的细胞源。
耳聋;胚胎干细胞;内耳祖细胞;耳上皮祖细胞;类毛细胞;细胞分化
浙江大学
硕士
遗传学
赵小立
2021
中文
R764.43
2021-12-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）