基于特异性定向偶联的抗AFB1免疫亲和柱的研究与应用
黄曲霉毒素是一类致癌、致畸、致突变的物质，由黄曲霉和寄生曲霉通过次级代谢产生，黄曲霉毒素B1因毒性更甚而被世界卫生组织划分为一级致癌物。目前常规检测黄曲霉毒素的方法为高效液相色谱、酶联免疫吸附等；样品中复杂的基质成分会影响样品检测的灵敏度甚至造成假阳性的现象。免疫亲和层析是样品预处理中常用的方法，能最大程度地特异性净化浓缩目标化合物并降低干扰和误差。纳米抗体相对单抗结构比较单一仅由重链抗体的可变区构成，且具有抗热性强、易表达、特异性好、亲和力高、耐有机试剂等优点。本研究利用基因工程将抗黄曲霉毒素B1纳米抗体（G8）与自我识别标签Halo-Tag融合表达，一步定向偶联制备抗黄曲霉毒素B1免疫亲和柱，优化免疫亲和柱的制备和使用条件，主要研究结果如下： 1.重组蛋白G8-Halo的融合表达及活性分析 利用基因工程技术成功构建原核表达载体pET-30a-G8-Halo，钙转至大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌中成功获得有活性的重组蛋白G8-Halo，确定了最佳诱导表达条件（IPTG浓度0.1mmol/L、诱导温度25℃、诱导时间6h）。经NI-NTA亲和层析得到了纯度较高的重组蛋白G8-Halo，纯化后的重组蛋白量可达4.4mg/L。通过间接竞争ELISA分析其IC50为2.27ng/mL；甲醇耐受性实验发现重组蛋白G8-Halo能耐受30%的甲醇，有利于提高免疫亲和柱的甲醇耐受性；热稳定性实验发现G8-Halo在37℃放置24d，还有55%左右的结合活性。 2.抗黄曲霉毒素B1免疫亲和柱的制备 重组蛋白G8-Halo与Halo-Tag配体一步自偶连，成功制备出特异性的抗黄曲霉毒素B1免疫亲和柱，该免疫亲和柱的最佳偶联时间为2h，制备过程和偶联时间大大被简化与缩短。免疫亲和柱在偶联5.48mg/mL融合蛋白时，对AFB1的吸附量最大为1.5μg/mL，柱容量至少提高了2.3倍左右。确定了制备的抗AFB1免疫亲和柱的最佳上样缓冲液条件（5%甲醇-PBS缓冲液，离子强度0.1mol/L，pH=7.4），在70%的甲醇浓度下完全能将AFB1洗脱。成功利用蛋白破碎上清偶联制备出免疫亲和柱，在偶联量为0.19mg、0.35mg时，分别能吸附43.35ng与70.89ngAFB1，为以后省去蛋白纯化步骤直接制备免疫亲和柱打下了基础。将AFB1标品和谷物样品进行加标回收，发现回收率都在80%~112%之间，能有效去除基质效应，净化浓缩AFB1。将自制的免疫亲和柱与公司购买的抗AFB1免疫亲和柱应用样品的实际检测，经配对t检验分析P=0.309＞0.05，其检测值无显著性差异。
AFB1;免疫亲和柱;纳米抗体;定向偶联
南昌大学
硕士
微生物学
付金衡;涂追
2021
中文
R392-33
2021-12-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）