筛选针对KRAS p.G12D位点突变蛋白的单链抗体
人类的3个RAS基因，KRAS,NRAS和HRAS，编码4种不同的RAS蛋白，这些蛋白都属于小GTPases蛋白家族，参与细胞信号的传导，具有“分子开关”的功能。RAS基因的激活突变是人类癌症中最常见的致癌驱动因素之一。其中，KRAS基因突变是最频繁的，在所有肿瘤的突变率中超过20％。最常见的基因突变是p.G12D和p.G13D位点突变。KRAS基因突变与肺癌、胰腺癌和大肠癌的发生有着密切的关系，是抗EGFR治疗反应的强阴性预测因子。然而，由于KRAS蛋白缺乏对药物的绑定，开发一种针对KRAS基因突变的靶向药物是非常困难的。 将抗体的重链可变区(heavy chain，VH)和轻链可变区(light chain，VL)，通过一段氨基酸短肽(Linker)连接而成的单链抗体（ScFv），保留了抗体活性的最小功能结构单位，同时降低了免疫排斥反应。ScFv也可作为靶向药物重要的一部分应用于嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）治疗。 CAR-T细胞疗法在治疗血液系统恶性肿瘤方面取得了显著成功，当前，正在进行广泛研究使CAR-T细胞用于实体瘤的疗法。因此，以KRAS G12D基因位点突变作为靶点筛选出高亲和力的ScFv用于CAR-T细胞免疫治疗，对于KRAS G12D基因突变的肿瘤患者带来希望。 目的： 本课题通过利用美国国立生物技术信息中心（NCBI，National Coalition Building Institute）官方网站基因数据库（Gene）检索KRAS蛋白的基因序列，设计合成KRAS及KRAS G12D重组蛋白。并利用噬菌体展示技术从全人源的噬菌体单链抗体库中筛选针对KRAS G12D位点突变蛋白的单链抗体，为后续的治疗奠定基础。 方法： 1.登录NCBI网站基因数据库（Gene），检索得到KRAS蛋白的基因序列，目的基因合成后选择在氨基酸序列C端添加His标签及Avi标签。交由武汉生物技术有限公司进行合成。 2.KRAS G12D的设计是将氨基酸第12位甘氨酸（G）突变为天冬氨酸（D）的碱基，具体是将野生型KRAS碱基序列的第35、36位的G和A，替换为A和T：与KRAS蛋白设计相同，在氨基酸序列C端添加His标签及Avi标签。将基因序列交由武汉生物技术有限公司进行合成。 3.利用生物素链霉亲和素结合的原理，采用液相筛选方法，先以KRAS野生抗原为靶点，与噬菌体单链抗体库进行亲和筛选，筛选除去与KRAS野生型抗原结合的噬菌体单链抗体，再将回收的噬菌体抗体库与KRAS G12D突变型抗原进行亲和筛选。第二轮与第三轮逐轮增加筛选压力，筛选出与KRAS p.G12D具有高亲和力且与KRAS野生抗原不结合的单链抗体。 4.将筛选出的单克隆利用酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）进行初步鉴定，挑选出阳性克隆送华大基因公司测序分析。 结果： 1.成功设计合成了生物素化的KRAS重组蛋白及KRAS G12D重组蛋白； 2.以生物素化的KRAS抗原和KRAS G12D抗原为靶点，通过三轮富集筛选，利用ELISA初步鉴定筛选出6个阳性克隆； 3.将6个阳性克隆送测序得到其基因序列，进一步通过序列分析，结果显示有2条序列为人免疫球蛋白可变区基因。 结论： 成功设计合成了生物素化的KRAS和KRAS G12D重组蛋白。针对KRAS G12D位点突变蛋白，筛选出2条具有高亲和力的单链抗体，为后续进一步的研究奠定了基础。
恶性肿瘤;免疫靶向治疗;单链抗体;KRAS基因突变
西安医学院
硕士
肿瘤学
白俊
2021
中文
R730.51
2021-12-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）