筛选针对EGFR p.T790M位点突变蛋白的单链抗体
目的：利用减数竞争筛选法对人源噬菌体抗体库进行筛选，得到靶向生物素化的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）p.T790M突变抗原的单链抗体(Single chain variable fragment，scFv)，并通过间接酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）验证所筛选的抗体的亲和力与特异性，选择高亲和力与特异性的阳性单克隆送测序获取其对应基因序列信息，为后续类嵌合抗原受体（chimeric-antigen receptor modified，CAR）分子的构建提供基础。 方法：1、通过在GenBank中查询人源EGFR蛋白的基因信息，设计并合成含有Avi-tag、His-tag标签的生物素化的EGFR p.T790M位点突变蛋白。 2、对经过滴度测定及文库多样性检测的全人源scFv噬菌体抗体库，借助链霉亲和素-生物素亲和筛选系统进行减数竞争筛选，得到靶向生物素化EGFR p.T790M位点突变蛋白的人源scFv次级噬菌体抗体库。 3、将筛选出的靶向生物素化EGFR p.T790M位点突变蛋白的次级噬菌体抗体库取部分涂于2YTAG平板上挑取单克隆菌株进行单克隆菌液的间接ELISA鉴定，通过对包被生物素化EGFR p.T790M位点突变蛋白及野生型EGFR蛋白酶标孔吸光度OD450数值的对比，挑取吸光度≧2倍的阳性克隆送测序，分析并获取所含scFv的基因序列。 结果：1、成功合成含有Avi-tag、His-tag标签的人源EGFR p.T790M突变蛋白，并对合成蛋白进行了体外生物素化，得到生物素化人源EGFR p.T790M突变蛋白。 2、通过以生物素化的EGFR p.T790M突变蛋白为靶抗原，对全人源scFv噬菌体展示文库利用减数竞争筛选法进行淘筛，得到了靶向EGFR p.T790M突变蛋白的次级噬菌体抗体库，库容约1×104pfu。 3、从利用减数竞争筛选法筛选的噬菌体培养平板上任意挑取260个单克隆，进行单克隆噬菌体间接ELISA验证，通过对比包被生物素化EGFR p.T790M位点突变蛋白及野生型EGFR蛋白酶标孔的吸光度OD450数值（包被突变型抗原/包被野生型抗原酶标孔OD450数值≧2倍为阳性克隆），获得4株阳性单克隆。通过对上述4个阳性单克隆进行测序分析，获得4条人源化靶向EGFR p.T790M突变蛋白的scFv基因序列。 结论：本研究利用减数竞争筛选法对生物素化EGFR p.T790M位点突变蛋白进行淘筛，获得了靶向EGFR p.T790M突变蛋白的次级抗体库，库容约为1×104pfu。对筛选所得的抗体利用单克隆噬菌体间接ELISA法验证，获得了4条特异性较高的全人源靶向EGFR p.T790M突变蛋白的scFv。
恶性肿瘤;分子靶向疗法;单链抗体;表皮生长因子受体;基因突变
西安医学院
硕士
肿瘤学
白俊
2021
中文
R730.51
2021-12-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）