筛选针对P53.R175H突变位点的蛋白的单链抗体
P53蛋白是一种抑癌蛋白，其主要功能是在肿瘤生长过程中控制细胞周期、DNA复制调控细胞分裂过程。当P53蛋白发生突变或聚集时，会失去抑制癌症的功能，转变为促癌因子从而促进肿瘤的发生和发展。在检测患者体内癌组织样本时发现，超过50%的癌组织均存在P53蛋白的突变体，并且在大多数癌症中，以氨基酸位置为175、245、248、249、273和282处的突变体居多。P53突变体R248Q，R248W和R175H突变在多种肿瘤组织中显示出聚集，形成稳定的蛋白聚集体进而激活其他基因表达程序，促进癌变以及耐药性的产生与被泛素-蛋白酶体系统迅速降解的WT-P53不同，P53突变体蛋白，如P53.R175H具有高度的稳定性，并倾向于形成更高阶的聚集体。鉴于P53突变蛋白在人类癌症中的广泛存在以及在疾病进展中发挥关键作用，靶向P53突变蛋白已经成为癌症潜在的治疗靶点。 分子靶向疗法主要依靠靶向特定分子（分子靶标）的药物或其他物质来阻断癌细胞的生长和扩散。理想靶标的发现对于癌症分子靶向疗法的成功开发至关重要。癌症发生的基础之一是基因组的改变，基因组的改变导致其所编码的蛋白质的结构和功能的改变，从而促进细胞存活和增殖。这些可以将癌细胞与正常细胞区分开的特定遗传改变，可以用作分子靶向药物开发中的分子靶标。破坏癌细胞为生存和生长而发展的特定机制是一种有选择地杀死癌细胞而对正常细胞影响最小的合理方法。在这方面，突变型P53是最好的靶标之一，因为一半以上的人类癌症具有P53突变，而正常细胞大多在P53基因中没有突变。利用以上特性，针对P53突变体的癌症靶向治疗策略也相应产生，其中通过靶向耗尽P53突变体蛋白可以作为一种对体内野生型P53蛋白影响最小的潜在策略之一。 重组单克隆抗体对细胞表面或细胞内抗原具有高度的特异性和亲和性，尽管其靶向作用显著但目前重组单克隆抗体在人类疾病治疗中应用并不广泛。单链抗体的出现克服了这些缺点。单链抗体是由抗体重链和轻链可变区通过接头（包含15至20个氨基酸）连接后组成的小分子抗体。与完整的单克隆抗体相比，由于单链抗体分子量与体积较小，其具有更好的组织渗透性、更快速的血液清除、显著降低的肾脏摄取以及较低的免疫原性等特性。单链抗体可在多种宿主中轻易生产，包括植物，酵母和微生物表达系统，特别是大肠杆菌。其可以通过常规杂交瘤技术生产，但是从该方法获得的抗体亲和力水平通常不足以有效地用于临床。因此，通过使用酵母、噬菌体、核糖体、mRNA等方法筛选大型组合抗体库，为有效富集特异性和高亲和力克隆提供了强大的平台。 目的： 本研究首先设计合成P53R175H位点突变的蛋白以及P53野生型蛋白，通过已经构建好的库容量为1X1013的人源性噬菌体单链抗体库，筛选出具有高亲和力和特异性的针对P53.R175H位点突变的单链抗体，为相关肿瘤的诊断及治疗提供新思路。 方法： 1、设计序列委托第三方合成P53.R175H位点突变的抗原蛋白及P53野生型表达的抗原蛋白； 2、以该抗原为靶抗原，通过液相筛选法，筛选出具有高亲和力的针对P53.R175H位点突变的单链抗体，且这些单链抗体不与野生型P53蛋白结合，具有较高的特异性； 3、通过ELISA验证筛选出来的单链抗体，鉴定获得的单链抗体亲和力和特异性。 结果：1、合成了P53野生型蛋白及P53.R175H位点突变的蛋白，筛选出4条与P53.R175H突变的蛋白高亲和力的单链抗体，且这些单链抗体与P53野生型蛋白表现出低亲和力2、经测序后判定这4条单链抗体与人源性IgG抗体轻重链可变区序列具有高度同源性。 结论： 合成了P53野生型抗原蛋白和P53.R175H突变的抗原蛋白。 筛选出具有高亲和力和特异性的针对P53.R175H突变位点的蛋白的人源性单链抗体，为相关肿瘤的诊断与治疗提供新的思路。
恶性肿瘤;分子靶向疗法;单链抗体;抑癌蛋白;基因突变
西安医学院
硕士
肿瘤学
白俊
2021
中文
R730.51
2021-12-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）