日本血吸虫复合B细胞表位抗原的研究
血吸虫病是一种严重危害人类健康的人畜共患寄生虫病。我国是全球血吸虫病危害最严重的国家(埃及、苏丹、中国、巴西)之一，我国流行日本血吸虫病，主要流行于长江流域及以南的12个省(市、自治区)的434个县（市、区），受威胁的人口约2亿。经50多年防治血吸虫病的不懈努力，我国血吸虫病防治工作已取得了巨大的成绩。但目前全国仍有109个县（市、区）有血吸虫病流行，病人数达84.25万，病畜约2.41万头。
血吸虫病的诊断在血吸虫病防治中起着极为重要的作用。随着血吸虫病防治措施的实施，流行区的感染度和感染率明显下降，以至血吸虫病经典的寄生虫学诊断方法－粪检的敏感性明显下降，并且由于粪便检查费工、费时、费力，疫区群众的依从性逐年下降，这种经典的寄生虫学诊断技术在现场大规模查病中的应用受到很大的限制。由于免疫诊断技术具有操作简便、敏感性较高、特异性较好等优点，因此发展免疫学诊断方法来代替或补充粪检为广大专业人员所采纳。常用的免疫学诊断方法所采用的检测抗原多为血吸虫成虫或虫卵抗原，这些抗原成分复杂且成本较高；而用基因工程方法制备完整的抗原虽可以获得较纯的抗原，但常常由于表达效率不高或纯化困难，因而限制了其的广泛应用。因此，人们迫切希望获得针对性强、诊断效率又高，并容易制备的抗原，以代替复杂的粗抗原或全长的分子抗原，使诊断更具有针对性，在保证抗原敏感性较高的前提下更进一步提高其特异性。
表位，又称抗原决定簇，是指免疫应答中被特异的效应分子或T、B淋巴细胞识别的抗原分子上的特定结构位点。B细胞表位是指抗原中可被B细胞抗原受体（BCR）或抗体特异性识别并相互结合的线性片断或空间构象型结构。B细胞表位的预测对于免疫原性多肽的设计、新型疫苗分子的设计都有很大的帮助，并且有利于诊断试剂的开发以及临床疾病的预防与诊断。近年来，随着免疫学理论、蛋白质工程技术的发展和生物信息学技术、计算机科学技术的广泛应用，人们对B细胞表位预测的研究方法和思维方法有了新的进展。随着对蛋白质的二级结构和理化性质的研究认识，B细胞表位预测得到了进一步的发展。但以一种抗原分子或者单一的表位抗原用于血吸虫病诊断的敏感性和特异性是有限的，所以我们设想采用多个抗原分子或者多个抗原的B细胞表位的复合，发展复合表位抗原，用于血吸虫病的免疫诊断。
本研究拟通过生物信息学软件BioSun分析在具有诊断潜能的四个日本血吸虫候选分子即日本血吸虫22.6 kDa膜蛋白（Sj22.6）、23 kDa膜蛋白（Sj23）、信号蛋白14-3-3(Sj14-3-3)和谷胱甘肽S转移酶（Sj26）中预测出相关的B细胞表位，采用分子生物学方法通过原核表达及纯化，表达产物经Western blot鉴定，获得可被血吸虫病人血清识别的表位抗原片断。通过随机顺序法连接相关候选表位，构建复合B细胞表位表达得到融合蛋白，再次通过Western blot证实其抗原性。进一步通过现场应用以评估该复合B细胞表位抗原用于血吸虫病免疫诊断的应用价值。
第一部分：日本血吸虫诊断分子B细胞表位的预测、构建、
表达和纯化
根据日本血吸虫中具有诊断潜能的四个候选分子即日本血吸虫膜蛋白22.6 kDa（Sj22.6）、23 kDa膜蛋白（Sj23）、信号蛋白14-3-3(Sj14-3-3)和谷胱甘肽S转移酶（Sj26）的氨基酸序列，用生物信息学软件BioSun分析和预测其B细胞表位，确定了8个候选表位（每个分子中选择2个表位片断）。设计并合成目的表位的编码核苷酸，克隆入高效融合表达载体pET-32c(+)，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，得到重组质粒，用酶切法及测序法鉴定。酶切和测序结果显示重组成功。阳性克隆经IPTG诱导表达，表达产物用Ni2＋-NTT柱纯化并在PBS中透析，获得了大量的可溶性候选表位融合蛋白，12％聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）显示为单一条带。经Western blot检测，P1～P8这8个目的蛋白中仅有P2（来自Sj22.6）、P6（来自Sj14-3-3）、P7（来自Sj26）可与血吸虫病人阳性血清反应而与健康人血清无反应，其余5个目的蛋白与血吸虫病人血清和健康人血清均无反应。表明这3条目的蛋白片断可能为具有潜在诊断价值的B细胞表位。
第二部分 日本血吸虫复合B细胞表位诊断分子的
构建与鉴定
鉴于一种抗原分子或者单一的抗原表位用于血吸虫病诊断的敏感性和特异性常常非常有限，我们设想采用多种抗原的B细胞表位的复合，构建复合B细胞表位诊断分子，以达到提高诊断血吸虫病效能作用。
根据上一个实验得到的三条B细胞表位片断P2（来自Sj22.6）、P6（来自Sj14-3-3）、P7（来自Sj26），用随机顺序法连接这三个候选B细胞表位片断，得到P2-P6-P7和P6-P2-P7这2个片断，并分别重组入高效融合表达载体pET-32c(+)，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，经酶切法和DNA测序鉴定获得重组质粒。经IPTG诱导表达，这2个质粒均可表达分子量约20.4KDa的融合蛋白，表达产物用Ni2＋-NTT柱纯化并在PBS中透析，12％聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）显示单一条带。抗原性鉴定结果显示这2个重组复合表位蛋白均可被日本血吸虫病人血清识别，而不与健康人血清反应，表明其具有诊断血吸虫病的潜能，为应用复合表位抗原诊断血吸虫病的研究奠定了基础。
第三部分 重组复合B细胞表位抗原用于血吸虫病
诊断的初步研究
用纯化的重组日本血吸虫诊断分子复合B细胞表位抗原作为检测抗原，建立间接ELISA方法，检测日本血吸虫感染者血清和非血吸虫病流行区健康者血清，以及肝吸虫和肺吸虫病人血清，并与可溶性虫卵抗原（SEA）进行比较，以评价该抗原用于血吸虫病免疫诊断的应用价值。
通过正交试验，获得了采用重组复合表位抗原CZ-1进行间接ELISA的最佳检测条件：重组抗原的包被浓度为10μg/ml，血清稀释度为1：200，酶标记的羊抗人IgG为1：1000。检测50份慢性血吸虫病感染者血清，均为阳性反应，敏感性达到100％；40份来自非血吸虫病流行区健康人血清，未见阳性反应。与相同条件下以SEA为抗原的检测结果相比较，结果相同。但检测15份肝吸虫病人血清，应用CZ-1抗原有1份（7％）阳性，SEA有3份（20％）阳性；20份肺吸虫病人血清，用CZ-1抗原有3份（15％）阳性，而SEA则有11份 （55％）阳性。
结果表明：重组复合表位抗原CZ-1的敏感性和特异性与可溶性虫卵抗原一致，但其与肝吸虫病人和肺吸虫病人血清的交叉反应性则明显低于可溶性虫卵抗原SEA，表明该抗原似具有较高的诊断效能。
日本血吸虫;B细胞表位;血吸虫病;复合B细胞表位;酶联免疫吸附试验;免疫诊断
江苏省血吸虫病防治研究所
硕士
病原生物学
朱荫昌
2006
中文
R532.21
92
2007-08-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）