鮸鱼miRNA调控NF-κB信号通路的研究
先天性免疫系统是抵御病原体入侵的第一道防线，识别入侵病原体的主要分子是模式识别受体（PRRs）。到目前为止，许多研究结果表明，免疫反应的激活和终止受到各种内源的调节分子及机制的调控。微小RNA（miRNA）是一组小的非编码RNA，它们通过与靶基因的3’非翻译区（UTR）结合来调控基因的表达，最终导致蛋白质翻译受阻或mRNA降解。已发现miRNA参与机体多种生物过程的调控，包括增殖和分化，癌症，细胞凋亡等。在哺乳动物中多达60％的mRNA都受到miRNA的调控。Toll样受体介导的NF-κB信号通路是调节机体免疫反应的一个关键信号通路。TLR是主要位于细胞表面的模式识别受体，通过活化转录因子NF-κB信号通路可介导机体响应各种特异性病原体的免疫反应。近来研究发现，miRNA也是鱼类免疫应答中复杂调控网络的关键组成部分。在本研究中选择了鱼类Toll样受体介导的NF-κB信号通路中的不同层次的信号分子作为对象，旨在发现参与调控这些关键信号分子的miRNA。这将为今后鱼类miRNA的功能研究和开发作为疾病诊断和治疗提供理论依据，具体的研究内容分以下几个方面： 1.调控接头蛋白分子MyD88的miRNA及其机制的研究 除TLR3以外，所有哺乳动物TLR均利用MyD88传递信号。MyD88是TLR信号通路中重要的接头分子，miRNA对接头分子的调控似乎比直接靶向TLR更有效。本研究利用生物信息学方法，预测与鮸鱼MyD883’UTR区域作用的miRNA。然后利用双荧光素酶报告基因检测系统，筛选出多个miRNA，包括miR-3570，miR-214及miR-148可以负调控荧光素酶活性。利用实时定量PCR及蛋白质免疫印迹技术，证实miR-3570和miR-214可以通过降低mRNA稳定性负调控MyD88的蛋白表达，而miR-148则被证实是从蛋白水平对进行MyD88的表达进行负调控，而且这种负调控是通过抑制蛋白的翻译但不影响其mRNA稳定性来实现的。随后证实了这三个miRNA在LPS诱导的炎症反应中的作用，发现它们可以通过抑制炎症因子的表达来调控机体的炎症免疫反应。最后，通过双荧光素酶报告基因检测系统及敲降MyD88基因实验，证实miR-3570，miR-214及miR-148可参与调控由MyD88介导的NF-κB信号通路。 2.调控信号分子IRAK4的miRNA及其机制的研究 IRAK4被称为关键接头蛋白分子激酶，并且已被证明是哺乳动物中Toll样受体介导的免疫反应的重要参与者。本研究利用生物信息学方法，预测可能结合于鮸鱼IRAK43’UTR区域的miRNA。然后利用双荧光素酶报告基因检测系统，筛选出两个miRNA，包括miR-203和miR-21可负调控荧光素酶活性。利用蛋白质免疫印迹及实时定量PCR实验，证实miR-203通过降低mRNA稳定性负调控IRAK4的蛋白表达，而miR-21则被证实是从蛋白水平对进行IRAK4的表达进行负调控，但不影响其mRNA的稳定性来实现。随后证实了miR-203和miR-21可负调控LPS诱导的炎症因子的表达。进一步的实验证实miR-203和miR-21可调控LPS刺激下的IRAK4介导的NF-κB信号通路。我们不但在鮸鱼这一物种中证实了miR-203和miR-21对IRAK4基因的调控作用，并且在其他硬骨鱼类中也证实了上述调控机制的存在。 3.调控转录因子p65的miRNA及其机制的研究 NF-κB途径的激活会导致一系列基因的转录，例如细胞因子及趋化因子等。大多数细菌可以与细胞膜表面的受体结合，从而触发NF-κB信号传导途径，通过改变基因表达来调控宿主细胞的免疫及炎症反应。本研究利用生物信息学方法，预测可能与p653’UTR区域的作用的miRNA。然后利用双荧光素酶报告基因检测系统，筛选出miR-216a可负调控荧光素酶活性。利用实时定量PCR及蛋白质免疫印迹技术，证实miR-216a可以通过降低mRNA稳定性来负调控p65的蛋白表达。随后，通过研究miR-216a的转录调控，证明了miR-216a启动子中的两个Ap1结合位点和四个Sp1结合位点对于miR-216a的转录过程是必不可少的。随后证实了miR-216a在LPS诱导的炎症反应中具有负调控作用。通过双荧光素酶报告基因检测系统进一步证实miR-216a是通过调控NF-κB信号通路达到抑制炎症因子的表达的目的。我们还发现miR-216a可以靶调控p65基因的表达这一调控机制在其他硬骨鱼类中也是存在的，证实了我们研究结果存在广泛性。
鮸鱼;MiRNA;负调控;NF-κB信号通路;炎症细胞因子
宁波大学
博士
水产养殖
陈炯;徐田军
2020
中文
S852.2
2021-11-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）