新型NLRP3炎性小体抑制剂：紫檀芪衍生物的设计、合成及抗炎活性评价
细胞对应激或感染的先天免疫应答依赖于模式识别受体来识别外源病原体相关分子或内源病原体相关分子。NLRP3炎性小体是一种重要的细胞内模式识别受体（NLRs），其不仅能够识别外源的病原相关分子模式（PAMPs）还能识别内源的病原相关分子模式（DAMPs），所以NLRP3跟多种疾病有关，并且NLRP3异常活化会导致自身免疫疾病发生。NLRP3炎性小体三个重要组分组成为NLRP3蛋白、接头蛋白ASC以及pro-caspase-1。当细胞处于正常状态时，接头蛋白ASC位于细胞核内，NLRP3蛋白与pro-caspase-1位于细胞质内。当细胞受到外源PAMPs或是内源DAMPs的刺激时，NLRP3蛋白可以通过招募接头蛋白ASC并与之结合，形成活化的NLRP3炎性小体复合物。活化的NLRP3炎性小体会导致pro-caspase-1活化成caspase-1，而活化的caspase-1可以切割pro-IL-1β和pro-IL-18的成熟和分泌，并且可以剪切GSDMD引起细胞焦亡。 目前，靶向NLRP3炎性小体活化的小分子抑制剂已有报道。但已报到的NLRP3炎性小体抑制剂筛选模型中，无论是基于计算机虚拟筛选的后续验证；还是直接的高通量筛选，均需要经过两个步骤。一是启动步骤：激活NF-κB通路；第二是活化步骤：激动剂活化炎性小体。然而，IL-1β不仅由NLRP3炎性体产生，而且还由其他炎性体或以其他独立方式产生，因此抑制IL-1β的分泌可能比抑制NLRP3本身带来更多的副作用。目前筛选流程不仅周期长、成本高，而且很容易脱靶。因此低成本、高效率的筛选模型对于靶向NLRP3炎性小体的先导化合物的发现尤为关键。 由于NLRP3炎性小体的活化会导致细胞焦亡，我们首先利用PI染色焦亡细胞，用Hoechst33342染色所有细胞核；再利用高内涵成像技术分别计数焦亡总细胞数和总细胞个数。通过比较焦亡率确定化合物生物活性。虽然其他炎性小体的活化也可以引起细胞焦亡，但是考虑到模型激动剂的选择性，结合相关实验证实了此筛选模型对筛选靶向抑制NLRP3炎性小体活化抑制剂具有专一性。利用高内涵筛选模型对化合物库进行筛选时，发现了先导化合物紫檀芪。虽然紫檀芪对NF-κB通路的抑制早有报道，但是在该筛选模型下，我们利用ELISA试剂盒检测中发现，紫檀芪对IL-1β的抑制作用远强于对TNF-α的抑制，这说明紫檀芪对NLRP3炎性小体的抑制远强于对NF-κB通路的抑制。这将对后期的改造具有重要意义。 接下来我们对紫檀芪进行了系统的构效关系研究。紫檀芪的羟基被取代得到化合物1-5，其在20μM下具有一定的焦亡抑制率。据报道，硝基乙烯基是靶向NLRP3的重要片段，因此，在紫檀芪2-位引入硝基乙烯基得到化合物6-10，抑制率显著提高。例如，化合物9在20μM和10μM浓度时的抑制率分别为57.87％和27.86％。但是如果将将6-9硝基乙烯基转化为三唑环，获得化合物12-15，抑制率显著降低，甚至某些化合物没有生物活性。基于这些发现，我们确定在紫檀芪2位位置引入硝基乙烯基来提高化合物活性。通过对化合物1-15的构效关系讨论，我们得出结论化合物11为优势结构，化合物11羟基上不同的取代基对活性影响很大。为了得到目标化合物，我们对化合物11的酚羟基得到化合物16-31。结果发现除了化合物30（20μM抑制率为70.09％）之外，其他衍生物与阳性对照相比，活性并没有质量的提高。因此我们进行了进一步的结构优化。 根据生物电子等排体原理，我们用氨基取代化合物11的酚羟基得到化合物32。与先前的化合物相比，其抑制率大大提高，在20μM、10μM浓度时对细胞焦亡抑制率分别为75.32%和54.74%。为了进一步确定在该化合物生物体内的活性，我们选择了DSS诱导的小鼠结肠炎模型。开展动物实验中，结果发现高浓度的组小鼠在体重、饮食、运动量、毛皮和精神等方面均低于低浓度组小鼠。更严重的是，高浓度组降低了小鼠的存活率。对小鼠解剖分析发现，虽然高浓度组化合物缓解小鼠结肠的黏连要优于低浓度组化合物，但体外利用L02细胞进行化合物安全性评价时，发现化合物32对人正常肝细胞株有很强的毒性。基于以上实验结果，我们认为化合物32虽然具有较好的抗细胞焦亡活性，但是体内具有明显的毒副作用。因此需要进一步优化改造以发现低毒高效的目标化合物。 通过酰胺缩合反应引入酰胺键，对化合物32的氨基进行改造得到化合物33-50。其中化合物33-36的活性随着碳链的延伸而逐渐降低，表明取代基的长度和柔性的增加不利于活性的提高。因此，我们降低了化合物的柔性，合成了化合物37-38，发现化合物37的活性明显高于化合物34。因此，考虑引入刚性基团，然后合成化合物39，但其活性明显降低，可能是因为取代基太大导致强烈的脂肪溶解性。参考化合物16-31的构效关系，在取代基中引入氧原子，并合成化合物39-42。发现化合物40的活性强于化合物39和41，因此，在β位置引入氧原子非常重要。由于氯原子的特性，我们引入了一个双键来取代氯原子并合成了45-46的化合物。 以上结果表明，合适的刚性取代基有利于提高活性，因此进一步引入环状取代基合成了化合物47-50。发现化合物47的抑制率较为突出（20μM，73.09％）。尽管化合物43的抑制率为89.97％，但其细胞毒性相对较强（LO2IC50=42.65μM）。与化合物43相比，化合物47的细胞毒性较弱（LO2IC50gt;100μM）。因此，通过一系列的活性改造与优化，在综合考虑活性和毒性之间的平衡的基础上，我们发现了低毒、高效的N-（4-（3,5-二甲氧基-2-（（E）-2-硝基乙烯基）苯乙烯基）苯基）环丙烷甲酰胺（化合物47）。体外实验发现化合物47在10μM时，对细胞焦亡抑制率为73.09%；对BMDMS细胞IL-1β分泌的抑制的IC50为0.56μM。考虑到小分子抑制剂的高效、安全性，我们用L02细胞检测化合物47的细胞毒性发现IC50gt;100μM。进一步研究发现化合物47能够抑制NLRP3炎性小体的活化，能够抑制IL-1β和caspase-1的分泌；同时化合物47能够抑制Nerigerin、ATP、MUS对NLRP3炎性小体的活化，说明化合物47是一个广谱的NLRP3炎性小体抑制剂；进一步的研究发现，化合物能够抑制ASC斑点的聚合，但是不影响ROS的产生；IP实验显示，化合物47能够抑制NLRP3炎性小体的组装；MST和CETSA试验说明化合物能够直接与NLRP3蛋白结合从而影响炎性小体的活化。 体内实验发现，化合物47能够缓解DSS诱导的小鼠急性结肠炎。进一步的病理学分析发现该化合物能够抑制结肠组织中杯状细胞的消失，同时能够抑制小鼠结肠组织中炎性因子的分泌，以及促炎蛋白NLRP3蛋白和COX-2蛋白的表达；对经典的炎性通路NF-κB与Stat3通路的活化同样有很好的抑制作用。亚急毒实验发现发现化合物47具有较好的安全性。 综上，本研究构建一个全新的NLRP3炎症小体抑制剂筛选模型，并利用此模型发现了一个苗头化合物紫檀芪，通过结构优化，最终设计合成了目标化合物N-（4-（3,5-二甲氧基-2-（（E）-2-硝基乙烯基）苯乙烯基）苯基）环丙烷甲酰胺（47），该化合物具有较为突出的体内外生物学活性。我们相信本次研究可以为NLRP3炎性小体抑制剂的发现提供了全新的方法，而且对NLRP3炎性小体药物的开发具有重要的意义。
NLRP3抑制剂;药物设计;合成工艺;紫檀芪衍生物;抗炎活性
安徽医科大学
博士
药物化学
刘新华
2021
中文
R914.2
2021-11-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）