浅部真菌病及深部真菌病分离菌株细胞外水解酶活性测定
目的： 真菌（fimgus)是生物界中重要的组成部分，致病真菌可感染人体导致真菌感染性疾病。真菌致病与多种因素密切相关，其所产生的水解酶是重要因素之一。部分真菌既可引起浅部感染，又可引发深部感染。其中，念珠菌和曲霉菌是引起人体深、浅部真菌病的主要致病菌种。为了适应不同的外界环境，真菌分泌的水解酶的活性及种类可能存在差异。本研究旨在通过模拟真菌感染人类时的深浅环境，探索浅部、深部真菌病的分离菌株在分泌水解酶活性、种类上的差异，进一步探讨真菌细胞外水解酶与真菌致病机制之间的关系。 方法： 1.收集2019年?2020年11月承德医学院附属医院皮肤性病科、检验科真菌培养阳性患者的菌株标本共211例。其中，浅部真菌菌株161例，深部真菌菌株50例。 2.收集的菌株接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA)上传代培养、保存。 3.对部分丝状真菌菌株进行小培养并制成玻片标本初步鉴定，初步鉴定为曲霉菌的采集图像并保留;所有念珠菌经念珠菌显色培养基鉴定有意义的菌株保留。 4.选取浅部、深部真菌菌株中初步鉴定相似菌株进行测序。其中，念珠菌6株，曲霉菌9株。 5.对浅部、深部测序结果为相同菌种的真菌菌株分别接种于含甲屑及皮屑的马铃薯液体培养基、含小鼠肠黏膜的马铃薯液体培养基中培养，含甲屑及皮屑的马铃薯液体培养基置于27℃培养箱模拟真菌生存的浅部环境，含小鼠肠黏膜的马铃薯液体培养基置于37℃培养箱模拟真菌生存的深部环境。 6.应用法国生物-梅里埃公司的酶活性试剂盒APIZYM进行细胞外水解酶活性测定，0-5标记相应的颜度深度。首先，采用试剂盒说明书的方法用α-糜蛋白酶进行质控实验；然后，对两种模拟环境中培养的真菌菌株分别进行离心、研磨、制备菌悬液，按试剂盒说明书测定细胞外水解酶活性。 7.采用SPSS26.0软件，行正态性检验，若符合正态分布，两组间比较使用t检验；不符合正态分布，釆用秩和检验。 结果： 1.将同一菌株的白念珠菌，分别于模拟的浅部环境和深部环境中进行培养，其产生的类脂酯酶(t=5.20，Plt;0.05)、酸性磷酸酶(t=5.20，Plt;0.05)、N-乙酰基-β氨基葡萄糖苷酶(t=5.20，Plt;0.05)的活性表达差异有统计学意义；将同一菌株的黑曲霉，分别于模拟的浅部环境和深部环境中进行培养，其产生的类脂酯酶（t=6.93,Plt;0.05)、酸性磷酸酶(t=6.93，Plt;0.05)、α-葡萄糖苷酶（t=5.20，Plt;0.05)的活性表达差异有统计学意义；将同一菌株的米曲霉，分别于模拟的浅部环境和深部环境中进行培养，其产生的α-半乳糖苷酶（t=5.20，Plt;0.05)、β-半乳糖苷酶（t=5.20，Plt;0.05)的活性表达差异有统计学意义。 2.于模拟的浅部环境中培养后，分别取自深部和浅部的黑曲霉的酸性磷酸酶（t=5.20，Plt;0.05)和a-葡萄糖苷酶（t=5.20，Plt;0.05)的活性表达差异有统计学意义；于模拟的浅部环境中培养后，分别取自深部和浅部的米曲霉的类脂酯酶（t=6.93，Plt;0.05)的活性表达差异有统计学意义。 3.于模拟的深部环境中培养后，分别取自深部和浅部的白念珠菌的酸性磷酸酶（t=6.93，Plt;0.05)的活性表达差异有统计学意义。于模拟的深部环境中培养后，分别取自深部和浅部的黑曲霉的类脂酯酶(t=6.93，Plt;0.05)的活性表达差异有统计学意义。于模拟的深部环境中培养后，分别取自深部和浅部的米曲霉的类脂酯酶（t=5.20,Plt;0.05)和β-半乳糖苷酶(t=5.20，Plt;0.05)的活性表达差异有统计学意义。 4.与模拟浅部环境中培养的取自浅部的白念珠菌相比,在模拟深部环境中取自深部的白念珠菌的类脂酯酶（t=5.20，Plt;0.05)的活性表达差异有统计学意义；与模拟浅部环境中培养的取自浅部的黑曲霉相比，在模拟深部环境中取自深部的黑曲霉的类脂酯酶（t=6.93，Plt;0.05)的活性表达差异有统计学意义；与在模拟浅部环境中培养的取自浅部的米曲霉相比，在模拟深部环境中取自深部的米曲霉的类脂酯酶(t=4.44，Plt;0.01)和α-半乳糖苷酶(t=4.47，Plt;0.01)的活性表达差异有统计学意义。 5.其余未提到的菌株的细胞外水解酶活性表达差异无统计学意义。 结论： 1.分别于模拟的深部环境、浅部环境培养后，白念珠菌的类脂酯酶、酸性磷酸酶、N-乙酷基-β-氨基-葡萄糖苷酶的活性变化有差异；黑曲霉的类脂酯酶、酸性磷酸酶、α-葡萄糖苷酶的活性变化有差异；米曲霉的α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶的活性有差异。 2.在模拟的深部环境中，分别取自深部、浅部的菌株对比发现：白念珠菌的酸性磷酸酶的活性变化有差异;黑曲霉的类脂酯酶的活性变化有差异；米曲霉的类脂酯酶、β-半乳糖苷酶的活性变化有差异。在模拟的浅部环境中，分别取自深部、浅部的菌株对比发现：黑曲霉的酸性磷酸酶、α-葡萄糖苷酶的活性变化有差异；米曲霉的类脂酯酶的活性变化有差异。 3.取自不同部位的同种菌株，在其原生存部位的培养后发现：白念珠菌和黑曲霉的类脂酯酶活性变化有差异；米曲霉的类脂酯酶、α-半乳糖苷酶活性变化有差异。
真菌病;分离菌株;细胞外水解酶;致病机制
承德医学院
硕士
皮肤病与性病学
陆洁
2021
中文
R756;R446.5
2021-11-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）