MALDI-TOF MS在快速检测碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌中的应用价值研究
目的： 1.分析承德医学院附属医院（我院）2018年12月至2020年10月碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌（carbapenem-resistantEnterobacterales，CRE）菌株的流行情况。2.评价酶水解法在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry，MALDI-TOFMS）仪快速检测产碳青霉烯酶肠杆菌目细菌（carbapenemaseproducingCRE，CP-CRE）中的应用价值。3.比较MALDI-TOFMS技术与PCR技术、酶免疫层析技术和改良碳青霉烯灭活试验检测碳青霉烯酶的诊断效能。 方法： 1．依据Vitek2.0鉴定和药敏结果选取2018年12月至2020年10月我院分离的所有非重复CRE菌株（共52株），随机选取同期我院36株碳青霉烯类敏感肠杆菌目细菌（CSE）和承德市中心医院40株CRE菌株，经VITEKMS（VITEKMassSpectrometry，VITEK质谱仪）再次鉴定细菌，纸片扩散法复核Vitek2.0检测的亚胺培南和美罗培南药敏结果；分析我院CRE菌株的流行情况。 2．以我院82株肠杆菌目细菌（52株CRE和30株CSE）为回顾性研究的研究对象，分别通过PCR技术和酶免疫层析技术做blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP和blaOXA-48碳青霉烯酶基因检测，通过改良碳青霉烯灭活试验（mCIM和eCIM）做碳青霉烯酶表型检测。 3．酶水解法预实验：将0.5McF菌悬液与不同浓度（4.0mg/mL、2.0mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL）的亚胺培南溶液35℃共孵育240min、120min、60min和30min，利用MALDI-TOFMS分析亚胺培南变化情况，筛选菌悬液浓度、亚胺培南浓度和孵育时间的最佳组合条件。为正式试验MALDI-TOFMS技术检测CP-CRE标准的建立提供依据。 4．首先以PCR技术为金标准了解我院82株肠杆菌目细菌（52株CRE和30株CSE）是否产碳青霉烯酶，再将细菌与亚胺培南共孵育做回顾性研究，通过VITEKMS评估待测菌株是否产碳青霉烯酶。定义logRQ=log亚胺培南水解产物峰强度/亚胺培南峰强度，绘制受试者工作特征曲线（ROC曲线）用以比较不同孵育时间（5min、10min、20min和30min）后细菌水解亚胺培南的情况，选择曲线下面积（AUC）最大的值计算诊断界值（Cutoff值）。当logRQ值≥Cutoff值时，试验菌株产碳青霉烯酶，为CP-CRE菌株。反之，该菌不产碳青霉烯酶。最后以同期承德市中心医院40株CRE和我院6株CSE做单盲法的前瞻性研究验证该酶水解法检测碳青霉烯酶的效果。 5.利用Kappa检验比较MALDI-TOFMS技术与PCR技术、酶免疫层析技术、改良碳青霉烯灭活试验的诊断效能。 结果： 1．我院CRE菌株的流行情况 VITEKMS和Vitek2.0的鉴定结果一致。鉴定结果显示我院52株CRE的组成如下：肺炎克雷伯菌37株、大肠埃希菌9株、阴沟肠杆菌4株、产酸克雷伯菌2株。我院52株CRE主要分布在老年病科（30.8%）、重症医学科（23.1%）和血液内科（15.4%），主要的标本来源是痰液（33.9%）、尿液（25%）和血液（23.1%）。 2．碳青霉烯酶检测结果 PCR技术和酶免疫层析技术的检测结果一致。我院52株CRE均检测出一种或一种以上的碳青霉烯酶基因，其中单blaKPC阳性占61.5%（32/52）、单blaNDM阳性占34.6%（18/52）、blaIMP阳性占1.9%（1/52）、blaKPC和blaNDM同时阳性的菌株占1.9%（1/52）；我院30株CSE均未检出碳青霉烯酶基因；同时我院碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（CR-KPN）中86.5%（32/37）为单blaKPC阳性菌株、8.1%（3/37）为单blaNDM阳性菌、2.7%（1/37）为blaIMP阳性菌株、2.7%（1/37）为blaKPC和blaNDM同时阳性的菌株，我院碳青霉烯类耐药大肠埃希菌（CR-ECO）均为单blaNDM阳性菌株（9/9）。 改良碳青霉烯灭活试验结果显示我院82株实验菌株中，mCIM试验阳性率61.0%（50/82）。其中18株mCIM试验和eCIM试验同时阳性。32株mCIM试验阳性但eCIM试验阴性。 3．酶水解法预实验结果 菌悬液浓度为0.5McF、亚胺培南浓度0.5mg/mL且孵育30min时，亚胺培南特征峰（300±0.55m/z）基本消失。延长孵育时间后试验结果无改变，增大药物浓度后，亚胺培南峰仍存在。预实验酶水解法的最佳条件是0.5McF菌悬液与0.5mg/mL亚胺培南共孵育30min。 4．酶水解法最佳孵育时间及Cutoff值的选择及验证 正式实验52株CRE的logRQ平均值为0.996±0.184，30株CSE的logRQ平均值为-1.419±0.187。孵育30min时AUC最大，为1.000（p＜0.001），所以酶水解法的最佳孵育时间为30min。Cutoff值为-0.678，52株CRE均为CP-CRE；30株CSE均不产碳青霉烯酶。通过ROC曲线可知孵育30min时酶水解法的灵敏度和特异度均为100%。前瞻性研究酶水解法显示，承德市中心医院的40株CRE均为CP-CRE，我院6株CSE均不产碳青霉烯酶，该结果与PCR结果一致性极强（Kappa=1.0）。 5．多种碳青霉烯酶检测方法的比较 经比较，MALDI-TOFMS技术与PCR技术、酶免疫层析技术均有100%的灵敏度和特异度，而改良碳青霉烯灭活试验灵敏度96.0%，特异度93.8%。 结论： 1.我院CRE菌株以肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌为主，且均产碳青霉烯酶，其中肺炎克雷伯菌以blaKPC为主，大肠埃希菌以blaNDM为主。同时，我院CRE菌株主要分布于老年病科、重症医学科和血液内科。临床医生可据我院CRE的流行情况合理的经验用药。 2.酶水解法中0.5McF菌悬液与0.5mg/mL亚胺培南共孵育30min，logRQ值大于等于-0.678时，待测菌株为CP-CRE。此方法全程仅需45min左右，灵敏度和特异度均100%，可用于微生物实验室产碳青霉烯酶CRE的常规检测。 3.在多种碳青霉烯酶检测方法中，基于酶水解法的MALDI-TOFMS技术灵敏度100%、特异度100%，能较其他方法更快速、准确、低成本的检测碳青霉烯酶，有利于及早确定病原菌、了解目标菌的耐药情况、指导临床精准用药，也有利于院感防控工作中及早切断传播途径，防止CRE的传播和流行。
肠杆菌目细菌;MALDI-TOFMS;酶水解法;碳青霉烯酶;PCR技术
承德医学院
硕士
临床检验诊断学
谢守军
2021
中文
R446.5
2021-11-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）