C/EBP-β通过miR-223调控下游两条关键信号转导通路修复损伤脊髓感觉传导功能
脊髓损伤（spinalcordinjury，SCI）是一种严重创伤性中枢神经系统疾病，可引起完全或不完全的运动和感觉功能丧失，并伴有高死亡率和高致残率。与运动神经功能异常相比，感觉神经功能异常引起的认知和心理障碍可能会在日常生活和生活质量方面给患者带来更明显的危害。目前，临床中仍然缺乏有效恢复患者感觉传导功能的治疗方法。 研究发现，作为转录因子，CCTA增强子结合蛋白β（CCAAT/enhancerbindingproteinβ，C/EBP-β）可以在整个中枢神经系统的神经元中表达，参与记忆形成、运动神经再生等过程。但是在SCI后C/EBP-β是否可以促进初级感觉神经元（primarysensoryneuron，PSN）轴突再生，恢复损伤脊髓感觉传导功能以及其可能作用机制目前尚未阐明。 目的： 本研究旨在应用体外和体内实验证明过表达C/EBP-β蛋白，能够通过miR-223调控下游PTEN/mTOR和FBX8/mTOR信号转导通路促进初级感觉神经元轴突生长，进而修复损伤脊髓感觉传导功能。 方法： 1、40只成年健康雌性Wistar大鼠，体重为200±25g，4只大鼠获取初级感觉神经元用于体外实验。培养的神经元随机分为阴性对照组（negativecontrol，NC）、C/EBP-β过表达组、miR-223Mimics组、C/EBP-βamp;miR-223Inhibitor组。36只大鼠随机分为3组用于体内实验：假手术组（Sham）只做T10椎板切除，另外2组均进行脊髓后索损伤造模并分为阴性对照组（Scramble）和C/EBP-β过表达组。 2、体外实验：应用双荧光素酶报告实验验证PTEN和FBX8是miR-223的靶基因。应用RT-qPCR检测PTEN和FBX8mRNA，从而阐明miR-223是通过抑制还是降解的方式干扰其靶基因PTEN和FBX8的表达。 3、应用细胞转染的方法，按照上述体外实验分组将培养的神经元进行转染。RT-qPCR对miR-223、PTEN和FBX8mRNA表达水平进行检测。WesternBlot检测PTEN、FBX8以及p-mTOR蛋白的表达情况。NF-200细胞免疫荧光观察和比较各组PSN的生长状态。Image-proplus6.0软件检测各组神经元轴突长度。验证过表达C/EBP-β给其靶点miR-223、下游通路蛋白、轴突长度带来的变化。 4、PSN中，在过表达C/EBP-β的同时抑制miR-223的表达，观察抑制miR-223是否阻断过表达C/EBP-β带来的生物学效应，以证明miR-223是C/EBP-β调控PSN轴突生长的关键靶点。 5、体内实验：应用体感诱发电位和胶带移除实验观察大鼠感觉功能恢复情况。然后对各组进行取材，NF-200免疫荧光染色观察和比较脊髓染色情况。WesternBlot实验对靶蛋白PTEN、FBX8以及通路关键蛋白p-mTOR表达水平进行检测。 结果： 1、miR-223可以靶向PTEN和FBX8，并通过降解mRNA的方式使其表达下调。 2、C/EBP-β可调控初级感觉神经元中miR-223表达，并下调PTEN和FBX8mRNA。 3、C/EBP-β可下调PSN中PTEN、FBX8蛋白表达，上调p-mTOR蛋白表达。 4、C/EBP-β和miR-223可以促进PSN轴突生长。 5、miR-223是C/EBP-β促进PSN轴突生长的关键靶点。 6、C/EBP-β能够调节脊髓后索损伤大鼠PSN中PTEN、FBX8和p-mTOR蛋白表达。 7、C/EBP-β能够修复脊髓后索损伤大鼠感觉传导功能。 结论： 过表达C/EBP-β蛋白能够使其关键作用靶点miR-223上调，下调PTEN和FBX8蛋白表达，通过mTOR信号转导通路促进初级感觉神经元轴突生长，进而修复损伤脊髓感觉传导功能。
脊髓损伤;初级感觉神经元;轴突再生
承德医学院
硕士
外科学
修玉才
2021
中文
R651.2
2021-11-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）