RSL3诱导多发性骨髓瘤细胞铁死亡的机制研究
目的：探讨RSL3是否能引起多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226发生铁死亡并探讨其作用机制。 方法： 1.CCK8法检测铁死亡诱导剂RSL3对细胞的活力的影响；CCK8法检测铁死亡抑制剂（Fer-1）、程序性坏死制剂（necrostatin-1）、凋亡抑制剂（z-vad-fmk）、自噬抑制剂（CQ）能否逆抑转RSL3对细胞的抑制作用； 2.流式细胞仪与荧光显微镜检测RSL3处理后各组细胞脂质过氧化物产生情况；比色法检测RSL3处理后各组细胞铁离子浓度； 3.实时定量PCR(RT-qPCR)法检测各组NCOA4和FTH1的mRNA相对表达情况；蛋白质免疫印迹法（WesternBlot）检测NCOA4和FTH1的蛋白表达情况； 4.用TRIzol法提取RNA，标本送往深圳华大科技股份有限公司进行全转录组测序（RNA-Seq）。使用DNBSEQ平台检测差异基因。差异基因的GO功能富集分析、KEGG通路富集分析均采用clusterProfiler软件，蛋白质互作网络使用String数据库构建(http://string-db.org/)分析; 结果： 1.RSL3可明显抑制RPMI8226细胞活力（plt;0.05），Fer-1和necrostatin-1均能部分逆转RSL3对细胞的生长抑制作用，其中铁死亡抑制剂Fer-1的逆转作用最为显著（plt;0.05）； 2.RSL3作用于细胞之后，脂质过氧化物水平明显增高随着RSL3的浓度增高而上升（plt;0.05）；不同浓度RSL3刺激作用下，亚铁离子水平无明显变化（pgt;0.05），差异无统计学意义。 3.RT-qPCR结果显示NCOA4和FTH1在各组RPMI8226细胞中均表达，与空白对照组（0uMRSL3）相比，不同浓度RSL3刺激作用下NCOA4mRNA水平下调，FTH1mRNA水平上调（plt;0.05）；WesternBlot结果显示铁自噬标志性蛋白NCOA4和FTH1各组RPMI8226细胞中均表达，不同浓度RSL3刺激作用下NCOA4基因水平下调，FTH1蛋白水平上调（plt;0.05）。 4.使用Desq2软件依据padjlt;0.05的标准计算实验组与对照组间的差异基因，全转录组测序差异基因分析提示，与对照组相比，实验组表达差异显著的基因共5个，分别是FTH1、HMOX1、AKR1C2、B4GALNT1，均为上调基因。通过差异表达基因GO富集分析，细胞组分主要富集在嗜铬颗粒、自噬溶酶体、次级溶酶体上；分子功能主要富集在氧化还原酶活性、胆汁酸结合能力、铁结合能力上；生物过程主要富集在细胞铁离子稳态、响应DNA损伤的凋亡信号通路等方面；通过差异基因KEGG富集分析，差异基因主要富集在铁死亡通路、矿物质吸收通路、糖鞘脂的生物合成通路与卟啉与叶绿素代谢上。 结论： 1.RSL3可以诱导多发性骨髓瘤细胞发生铁死亡； 2.RSL3诱导的多发性骨髓瘤细胞铁死亡中有铁自噬的参与； 3.RSL3可能通过调控FTH1、HMOX1等铁代谢基因发挥相关功能。
多发性骨髓瘤;RSL3;铁死亡;铁代谢;自噬作用;全转录组测序
承德医学院
硕士
血液科
郝长来
2021
中文
R733.3
2021-11-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）