补阳还五汤联合水蛭对脑梗死大鼠神经元自噬的影响
缺血性脑卒中又名“脑梗死”(Cerebralischemicstroke,CI)，中医也称之为“中风”，是由炎症、动脉粥样硬化斑块脱落等诱因引发局部血液循环障碍导致脑组织坏死及神经功能受损的脑部疾病。脑梗死也是一种致残率极高的疾病，患者通常表现为语言、行为、记忆等功能障碍。至今每年新增脑梗死患者已突破百万，并有逐渐“年轻化”趋势，因此对脑梗死疾病的进一步研究意义重大。脑梗死引发组织及神经细胞缺血、缺氧，受到刺激下的机体自噬反应被激活。神经元自噬作为机体内环境应对受损细胞及细胞器的应激反应是研究保护脑梗死损伤机制的重要途径。祖国医学认为脑梗死隶属于“中风”范畴，是由于气阴亏虚、风痰结瘀而致脑络瘀阻不畅。补阳还五汤以黄芪为君，补气活血、疏通经络作用显著是中医临床用于治疗脑梗死疾病的经典方剂之一，水蛭又是以逐瘀通经、消癥散结为主要作用的虫药，二者在脑梗死治疗中具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等药理作用，在补阳还五汤中加入水蛭可增强原复方疏通经络、驱逐瘀血的作用，但补阳还五汤联合水蛭对脑梗死的治疗作用是否与神经元自噬具有相关性还尚未可知，补阳还五汤联合水蛭对神经元的自噬影响也未见报道，因此本实验建立新式软体性自体血微栓子脑梗死大鼠实验模型，为脑梗死的临床治疗提供新的实验动物模型，并观察补阳还五汤联合水蛭对脑梗死大鼠模型神经元自噬及其神经功能的影响，为补阳还五汤联合水蛭治疗脑梗死提供实验依据。 目的： 成功利用软体性自体血微栓子注入技术制备CI动物模型，通过检测微管自噬相关蛋白1轻链3II（Microtubuleassociatedprotein1lightchain3-II,LC3-II)、自噬接头蛋白P62(P62/Sequestosome1,P62)、酵母自噬相关蛋白Beclin-1的含有量，探究补阳还五汤联合水蛭对梗死后引发的神经元自噬的影响。 方法： 首先雄性SD大鼠，采用改良传统栓塞法利用软体性自体血微栓子注入颈动脉的方法制备CI大鼠模型，经过行为学巴恩斯迷宫和水迷宫、红四氮唑染色(2、3、5-Triphenyte-trazoliumchloride,TTC)、苏木素-伊红染色(Hematoxylin-eosinstainin,HE)、免疫组织化学法(Immunohistochemistry,IHC)检测神经元核抗原(Neuronalnuclearantigen,Neun)蛋白、免疫荧光(Immunotissuefluorescence,IF)法检测Neun蛋白确定CI模型的成功制备，然后重新饲养雄性SD大鼠重复进行CI建模操作。经过Longa法进行神经功能评分筛选后，随机分为假手术、模型组、补阳还五汤联合水蛭药物低、中、高剂量组(15g·Kg-1、30g·Kg-1、45g·Kg-1)灌胃治疗,同时设置依达拉奉（0.006g·Kg-1）阳性药物对照组尾静脉注射，连续药物干预14d，水迷宫和巴恩斯迷宫检测行为记忆能力，组织取材做TTC染色并制作HE染色切片观察梗死脑组织病理变化;免疫组织化学检测各组间梗死脑组织LC3-II、P62、Beclin-1所呈现的表达位置及蛋白表达量的不同。采用免疫蛋白印迹(Westernblot,WB)和实时定量荧光PCR(Real-timequantitativePCR,qPCR)检测LC3-II、P62、Beclin-1在基因层面的表达情况。所有数据分析和统计数据均使用SPSS21.0统计软件进行分析。通过单向方差分析对测量数据进行分析，最后以（?X±S）的形式表示。Plt;0.05被认为具有统计学意义。 结果： 1第一部分新式软体性自体血微栓子CI大鼠实验模型制备的结果 1.1行为学实验结果 巴恩斯迷宫实验，随实验次数增加，假手术组和模型组大鼠的潜伏期均逐渐缩短，寻找目标洞的错误次数逐渐减少。与假手术组相比，模型组大鼠进入目标洞的时间延长了54.58%，寻找目标洞期间探究错误洞次数增加了45.78%，差异均有统计学意义（Plt;0.05）。 水迷宫实验，与假手术组比较，模型组大鼠潜伏期延长了136.74%，有统计学差异（Plt;0.05）。在空间探索部分，与假手术组相比，模型组大鼠穿台次数减少了19.41%，在原放置平台的目标象限的逗留时间减少了18.09%，均有统计学差异（Plt;0.05）。 1.2TTC染色结果 结果表明，脑组织的梗死区域呈现灰白色，非梗死部分为鲜红色，与假手术组对比，经过造模手术的大鼠脑组织的梗死区域明显。 1.3HE染色结果 结果显示，假手术组大鼠脑组织海马神经元排列较为整齐大致为3-4层，脑皮质中神经元分布均匀；模型组大鼠脑组织光镜下可见多处梗死灶，梗死灶呈现为筛网状，组织部分丢失、大量神经元丢失，细胞核可见嗜伊红现象，模型组大鼠海马神经元排列较假手术组杂乱，细胞带结构不完整。 1.4IHC结果 在假手术组和模型组中，海马和皮层神经元的细胞核和细胞质显示出Neun表达的棕黄色颗粒。假手术组海马和皮层神经元的细胞核和胞浆高表达，颜色较深。与假手术组比较，模型组海马着色较浅，阳性表达降低了7.40%，梗死灶周围有神经元丢失，出现空洞，梗死灶周围神经元Neun表达降低了31.95%，均有统计学差异(Plt;0.01)。1.5IF结果 结果显示，Neun免疫荧光单染对比发现,在细胞核和胞浆中均可见荧光表达，与假手术组相比，模型组Neun阳性表达荧光亮度较弱。 2第二部分补阳还五汤联合水蛭对CI大鼠神经元自噬的影响结果 2.1实验动物模型筛选 进行造模手术大鼠共计70只除去死亡后经过功能评分筛选≥1且＜4的纳入成功造模的共60只，成功率85.71%，分组时另设假手术组。 2.2行为学检测结果 在巴恩斯迷宫实验中各组大鼠随时间推移，潜伏期均呈现递减趋势。与假手术组比较，模型组大鼠寻找目标洞的潜伏时间增长了132.65%，进入错误洞的次数增加了157.47%，两项指标均有显著统计学差异（Plt;0.01）；与模型组比较，经过补阳还五汤联合水蛭低、中、高剂量组及依达拉奉对模型大鼠的阶段治疗后，潜伏时间分别缩短了12.76%、11.80%、7.18%、22.95%，进入目标洞的错误次数分别减少5.67%、11.85%、13.87%、28.12%，均有统计学差异（Plt;0.05）。在水迷宫测试中，各实验组大鼠的逃避潜伏期随实验次数增加逐渐缩短。与假手术组比较，模型组大鼠定位航行的潜伏期增加了201.72%，空间探索实验中穿越平台的次数减少42.72%，平台象限停留时间较少39.15%，均有显著统计学差异（Plt;0.01）；与模型组比较，补阳还五汤联合水蛭低、中、高剂量及依达拉奉治疗组的定位航行潜伏期分别减少43.48%、51.46%、34.14%、57.02%，均有统计学差异(Plt;0.05)，穿台次数增多22.58%(Plt;0.05)、6.68%(Plt;0.05)、28.23%(Plt;0.05)、39.37%(Plt;0.01)，在目标象限停留时间分别增加了14.13%、25.10%、5.59%、27.13%，差异均有统计学意义（Plt;0.05）。 2.3TTC染色结果 经过TTC染色结果显示白色为梗死部分，红色为非梗死部分，与假手术组比，模型组梗死体积显著大于假手术组(Plt;0.01)；与模型组比，补阳还五汤联合水蛭各治疗组梗死体积比不同程度减小(Plt;0.01)。 2.4HE染色结果 HE染色，假手术组大鼠海马神经元分2-3层，细胞大而圆，胞核蓝紫色，核仁清晰，细胞质为紫红色，皮质中神经元细胞结构完整，呈圆形或多边形，细胞分散均匀；模型组大鼠脑组织有明显梗死灶，海马细胞排列混乱神经元个数有所减少，皮质梗死灶周围出现筛网状样结构，神经元细胞不完整，细胞核固缩，甚至出现神经元丢失以及嗜伊红的现象；给药组干预治疗后大鼠较模型组梗死病变情况减轻，梗死周围正常神经元密度增大。 2.5IHC结果 LC3-II免疫组化实验可明显看到假手术组细胞核复染的蓝色，模型组及其它各治疗组胞浆出现棕黄色颗粒沉着。与假手术组比较，模型组大鼠神经元胞浆和细胞膜出现大量深黄棕色颗粒125.87%，(Plt;0.01)；与模型组比较，补阳还五汤联合水蛭低、中、高剂量及依达拉奉药物组LC3-II表达降低了16.20%、12.56%、20.81%、25.84%，均有统计差异（Plt;0.01）。 P62棕黄色免疫阳性表达颗粒沉积在神经元的细胞浆内，与假手术组比较，模型组胞浆和胞膜的阳性表达降低了24.33%，(Plt;0.01)；与模型组比较，补阳还五汤联合水蛭低、中、高剂量及依达拉奉治疗组P62阳性表达分别升高了17.14%、34.74%、10.09%、45.07%，均有统计差异（Plt;0.01）。 Beclin-1免疫阳性产物表达在神经元细胞的胞浆及包膜，呈棕黄色颗粒状。与假手术相比，模型组Beclin-1表达增加了217.86%，有显著统计学差异（Plt;0.01）；与模型组相比，补阳还五汤联合水蛭低、中、高剂量及依达拉奉药物组Beclin-1阳性表达分别降低了30.33%、15.57%、4.33%、6.42%，除补阳还五汤联合水蛭高剂量组外，其余各组差异均有统计差异（Plt;0.01）。 2.6WB结果 经过免疫蛋白印迹实验检测脑组织LC3-II、P62、Beclin-1蛋白含量。与假手术组相比较，模型组LC3-II蛋白含量增加65.00%，(Plt;0.01)；与模型组相比，补阳还五汤联合水蛭低、中、高剂量及依达拉奉组（下述各药物组顺序同）脑组织LC3-II蛋白含量分别下降了49.49%、22.22%、22.22%、45.45%，均有统计学差异（Plt;0.01）。 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织P62蛋白含量下降了27.78%，(Plt;0.05)；与模型组相比，各药物组的P62蛋白含量分别升高了23.08%(Plt;0.01)、35.38%(Plt;0.05)、49.23%（Plt;0.01）、83.08%（Plt;0.01），均有显著统计学差异。 与假手术组相比，模型组Beclin-1蛋白表达含量明显增加了30.00%，（Plt;0.01）；与模型组相比，各药物组Beclin-1的含量分别下降了16.23%（Plt;0.05）、13.68%（Plt;0.05）、15.38%（Plt;0.05）、18.80%(Plt;0.01)，均有显著统计学差异。 2.7qPCR法检测结果 与假手术组比较，模型组LC3-IImRNA的表达升高了222.00%，(Plt;0.01)；与模型组相比，补阳还五汤联合水蛭低、中、高剂量及依达拉奉组（下述各药物组顺序同）LC3-II的mRNA表达分别下调了19.70%、66.15%、51.86%、77.64%，均有显著统计学差异（Plt;0.01）。 与假手术组比较，模型组P62的mRNA表达降低了25.00%，Plt;0.01；与模型组比较，各药物组P62的mRNA表达都分别上调了20.00%(Plt;0.01)、61.33%(Plt;0.05)、33.43%(Plt;0.01)、33.34%(Plt;0.01)，均有显著统计学差异。 与假手术组比较，模型组Beclin-1的mRNA表达升高了20.00%，(Plt;0.05)；与模型组相比，补阳还五汤联合水蛭各药物组Beclin-1的mRNA表达分别下降了68.33%(Plt;0.01)、10.83%(Plt;0.05)、24.17%(Plt;0.05)，均有统计学差异，依达拉奉药物组Beclin-1的mRNA表达降低了3.33%，无统计学差异（Pgt;0.05）。 结论 1.通过新式软体性自体血微栓子的注入可以成功制备CI实验动物模型，这种造模方式可以成功诱发神经损伤及行为记忆功能障碍。 2.补阳还五汤联合水蛭对新式软体性自体血微栓子制备的CI大鼠模型阶段治疗后，有利于改善CI大鼠行为记忆障碍。 3.补阳还五汤联合水蛭治疗CI大鼠通过不同程度调控LC3-II、P62、Beclin-1三种蛋白的含量进而达到抑制自噬强度、防止过度自噬反应发生、降低CI后神经元死亡加重扩大损伤、保护脑组织的效果。
脑梗死;补阳还五汤;水蛭;微栓子;神经元自噬
承德医学院
硕士
中药学
吴晓光
2021
中文
R743.3;R283.661
2021-11-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）